本文主要介紹美國(guó)斯坦福大學(xué)叢樂課題組在《Nature Cell Biology》雜志上發(fā)表的《dCas9-based gene editing for cleavage-free genomic knock-in of long sequences》論文，該文章介紹了一種新型的基因編輯工具—dCas9-SSAP。

基因編輯是基因組和細(xì)胞工程的強(qiáng)大工具。以CRISPR–Cas為例，基因編輯可能導(dǎo)致DNA損傷并觸發(fā)DNA修復(fù)過程，而這些過程往往容易出錯(cuò)。當(dāng)改變長(zhǎng)序列時(shí)，這種不想要的突變和安全問題可能會(huì)更加嚴(yán)重。作者將微生物單鏈退火蛋白（SSAP）與無催化活性的dCas9偶聯(lián)用于基因編輯。這種無切割的基因編輯器dCas9–SSAP促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)序列的敲入。dCas9–SSAP編輯器具有較低誤差和最小的偏離，顯示出比出傳統(tǒng)Cas9方法更高的準(zhǔn)確性。它對(duì)插入數(shù)量級(jí)為千的堿基規(guī)模的序列是有效的，效率高達(dá)約20%。作者進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了截短和適體改造，以最大限度地減小其大小，以適應(yīng)未來應(yīng)用的單個(gè)腺相關(guān)病毒載體。總之，這一工具為更安全的長(zhǎng)序列基因組編輯提供了一種方法。

圖1 Schematic model of the dCas9–SSAP editor

一、提出假設(shè)：SSAP可能不依賴于DNA切割，并不具有ATP依賴性

大多數(shù)能夠長(zhǎng)序列敲入的基于CRISPR的編輯器需要單鏈缺口或DSB，這可以觸發(fā)容易出錯(cuò)的NHEJ途徑，從而導(dǎo)致可變的效率和準(zhǔn)確性。相反，噬菌體通過重組系統(tǒng)將自身整合到宿主細(xì)菌中，例如λRed。這種精確的噬菌體整合依賴于同源性導(dǎo)向的具體過程是：由SSAP刺激的基因組和供體DNA之間的重組，即lambda Bet或其同源物RecT。根據(jù)之前的研究，作者推斷噬菌體SSAP可能不依賴于DNA切割，因?yàn)槠浠钚院懿粚こ＃⒉痪哂蠥TP依賴性，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的ATP依賴性RAD51形成對(duì)比。當(dāng)多個(gè)SSAP通過RNA引導(dǎo)的dCas9募集到基因組靶點(diǎn)時(shí)，SSAP對(duì)單鏈和雙鏈DNA的高親和力可能允許附著到供體上。然后，它可以在不切割的情況下促進(jìn)DNA置換，因?yàn)樵赿Cas9介導(dǎo)的DNA解鏈和R環(huán)形成過程中，DNA鏈變得可瞬時(shí)進(jìn)入。

基于這一假設(shè)，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)系統(tǒng)，將SSAP招募到催化失活的dCas9中（圖1）。dCas9蛋白不能切割DNA，但保留了解開靶位點(diǎn)并形成R環(huán)的能力，使非靶鏈被認(rèn)為可用于SSAP刺激的同源重組。為了測(cè)試這一點(diǎn)，作者設(shè)計(jì)并評(píng)估了三種主要的微生物SSAP：λ噬菌體Bet、大腸桿菌Rac原噬菌體RecT和噬菌體T7 gp2.5。作者通過RNA適體MS2將SSAP募集到化膿性鏈球菌Cas9的失活版本-dSpCas9（以下簡(jiǎn)化為dCas9）中（圖2）。

圖2 Construct designs for screening the gene-editing efficiency of SSAPs using a genomic knock-in assay with an 800-bp 2A–mKate transgene. NLS, nuclear localization sequence.

將該MS2適體插入單一引導(dǎo)RNA（sgRNA）支架中，并將候選SSAP與特異性結(jié)合MS2適配體的C末端MS2外殼蛋白（MCP）融合，從而使多個(gè)SSAP與dCas9 gRNA形成復(fù)合物。

為了測(cè)量它們?cè)谌祟惣?xì)胞中的基因編輯活性，作者用編碼熒光蛋白表達(dá)盒的800bp轉(zhuǎn)基因提供供體，該熒光蛋白表達(dá)盒兩側(cè)有同源臂（HA），該同源臂允許熒光蛋白插入持家基因框架內(nèi)，例如DYNLT1、HSP90AA1和ACTB（圖3）。

圖3 Design of the genomic knock-in assay to measure the level of gene-editing efficiency. FL, fluorescent; PAM, protospacer adjacent motif.??

在精確敲入后，作者測(cè)量了熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞的百分比，以量化基因編輯效率（圖4）。作者的測(cè)試表明，相對(duì)于人類細(xì)胞中的其他SSAP，RecT具有更高的編輯活性，而沒有編輯僅用dCas9或非靶向?qū)φ沼^察到上述背景（圖4）。作者使用成像、凝膠電泳和測(cè)序驗(yàn)證了將SSAP與dCas9偶聯(lián)能夠進(jìn)行基因敲入編輯。

圖4 Knock-in efficiency of the initial screen of three SSAPs: Bet protein from lambda phage (LBet), RecT protein from Rac prophage (RecT) and gp2.5 from T7 phage (gp2.5). NTC, non-target control. Donor templates with HA lengths of approximately 200?bp (DYNLT1) and 300?bp (HSP90AA1 and ACTB) were added in all groups, except the no-donor controls. The error bars represent the s.e.m. of n=?3 biologically independent experiments.

二、dCas9–SSAP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的開發(fā)

然后，作者進(jìn)行了宏基因組挖掘，以確定哺乳動(dòng)物基因編輯的最佳SSAP。作者專注于RecT同源物，并試圖通過系統(tǒng)發(fā)育分析最大限度地提高進(jìn)化多樣性。作者在NCBI非冗余序列數(shù)據(jù)庫中搜索RecT同源物，并確定了2071個(gè)初始候選。接下來，作者構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)進(jìn)化分支進(jìn)行了子采樣，并獲得了16個(gè)SSAP候選者（圖5）。作者通過測(cè)量三個(gè)基因組位點(diǎn)的編輯效率水平來評(píng)估SSAP候選者。

圖5 Phylogenetic tree and amino acid alignment of representative RecT homologues along with the protein conserved domain annotated.??

作者通過測(cè)量三個(gè)基因組位點(diǎn)的編輯效率水平來評(píng)估SSAP候選者。在所有候選者中，EcRecT顯示出dCas9編輯的最高效率，在人類細(xì)胞中的效率約為6%。這明顯高于不含SSAP的dCas9對(duì)照組，后者與無供體對(duì)照組相當(dāng)，表明單獨(dú)的dCas9不能進(jìn)行有效的敲入。作者還用不識(shí)別基因組靶標(biāo)的gRNA的非靶標(biāo)對(duì)照測(cè)試了SSAP，證實(shí)單獨(dú)表達(dá)SSAP不足以敲入（圖4）?？傊?，所提出的dCas9–SSAP編輯器可以在人體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的敲入。

三、dCas9–SSAP編輯精確性的表征

開發(fā)dCas9–SSAP的動(dòng)機(jī)是在SSAP的幫助下進(jìn)行更安全、無切割的敲入編輯。因此，作者通過實(shí)驗(yàn)評(píng)估了dCas9–SSAP針對(duì)長(zhǎng)度約1 kb的序列進(jìn)行敲入編輯的準(zhǔn)確性。與Cas9參考文獻(xiàn)相比，作者測(cè)量了dCas9–SSAP的靶上誤差、脫靶插入、細(xì)胞適應(yīng)度效應(yīng)和編輯產(chǎn)量。

A.靶上誤差

有兩種類型的目標(biāo)錯(cuò)誤：（1）僅插入indel，其中插入了不需要的indel，但沒有模板；（2）不完全敲入，其中插入了完整或部分模板，但在敲入連接處發(fā)生了indel。

為了評(píng)估類型（1），作者使用深度測(cè)序來測(cè)量dCas9編輯器的靶向信息。作者使用了在供體DNA外具有初始引物結(jié)合位點(diǎn)的嵌套PCR設(shè)計(jì)，以避免模板污染（圖6）。

深度測(cè)序顯示，dCas9編輯器的靶向誤差水平與陰性對(duì)照組觀察到的誤差水平一樣低，而Cas9編輯器觀察到的indel水平較高（圖6）。

圖6 On-target indel errors (800-kp knock-in). Deep sequencing was used to measure the levels of indel formation when using dCas9–SSAP and Cas9 references at the endogenous targets DYNLT1 (left) and HSP90AA1 (right). HDR templates with a 200-bp HA were used as the donor template. Details of the assay are provided in Methods; n=?3 biologically independent experiments.?

為了評(píng)估類型（2），作者以dCas9–SSAP的引入誤差為基準(zhǔn)，并測(cè)量了敲入連接處indels。作者克隆分離編輯的細(xì)胞，使用類似的兩步嵌套PCR設(shè)計(jì)擴(kuò)增敲入基因組基因座以避免污染（圖7），并通過Sanger測(cè)序評(píng)估編輯的基因組等位基因。長(zhǎng)讀Sanger測(cè)序使作者能夠檢查全部的敲入連接處情況。

圖7 On-target knock-in errors (800?kp knock-in). Clonal Sanger sequencing analysis of the accuracy of knock-in editing using dCas9–SSAP and Cas9 references with different MMEJ and HDR templates. The MMEJ and HDR donor templates had HAs of 25?bp and approximately 200 bp, respectively (Methods). c–e, Genome-wide detection of insertion sites of the knock-in cassette using unbiased sequencing.

盡管MMEJ供體在使用Cas9時(shí)比HDR供體更有效，但它們也導(dǎo)致了更高百分比的編輯錯(cuò)誤（圖2b）。更重要的是，就沒有敲入錯(cuò)誤的克隆百分比而言，dCas9–SSAP優(yōu)于Cas9 HDR和Cas9 MMEJ（圖7）。

B. 脫靶插入

作者還通過全基因組轉(zhuǎn)基因插入分析評(píng)估了dCas9–SSAP編輯的脫靶敲入錯(cuò)誤率（圖8-10）。簡(jiǎn)言之，作者分離了高分子量基因組DNA，然后進(jìn)行片段化和唯一分子識(shí)別器（UMI）-銜接子連接，并使用轉(zhuǎn)基因特異性引物對(duì)基因組插入位點(diǎn)進(jìn)行無偏鑒定（圖8）。通過由Cas9全基因組脫靶分析（方法）修改的先前驗(yàn)證的分析方法，鑒定了代表高豐度轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的富集讀數(shù)峰（圖9）。

圖8? representative reads aligned at the knock-in genomic site??

圖9 summary of the detected on-target and off-target insertion sites??

圖10 summary of the detected on-target and off-target insertion sites are presented??

考慮到插入位點(diǎn)占總比對(duì)讀數(shù)的>1%，作者的結(jié)果證實(shí)，dCas9–SSAP沒有顯示出可檢測(cè)的脫靶插入，而Cas9參考文獻(xiàn)導(dǎo)致了大量的脫靶嵌入事件（圖10）。值得注意的是，與Cas9編輯器相比，當(dāng)作者考慮dCas9–SSAP樣本中至少有一個(gè)UMI對(duì)齊的所有位點(diǎn)時(shí)，脫靶位點(diǎn)更少。這一結(jié)果表明，dCas9–SSAP可以幫助解決在長(zhǎng)序列敲入中脫靶這一突出問題。

C. 細(xì)胞適應(yīng)度效應(yīng)與編輯產(chǎn)量分析

作者還比較了基于Cas9/dCas9的編輯的細(xì)胞的適應(yīng)度。作者試驗(yàn)了兩個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)；作者的數(shù)據(jù)表明，dCas9編輯導(dǎo)致比Cas9更高的細(xì)胞適應(yīng)度（圖11，12）

為了全面了解情況，作者與Cas9參考文獻(xiàn)相比，dCas9–SSAP的編輯產(chǎn)量。作者列出了準(zhǔn)確的插入、有誤差的引入和沒有引入的目標(biāo)誤差的百分比，其中后兩者的總和是目標(biāo)誤差總和（圖13）。作者還測(cè)量了編輯的總體準(zhǔn)確性，定義為成功敲入細(xì)胞與總編輯細(xì)胞的比率（圖13）。作者觀察到，Cas9編輯器在長(zhǎng)序列編輯中經(jīng)常出現(xiàn)錯(cuò)誤，錯(cuò)誤編輯的百分比明顯高于產(chǎn)量，準(zhǔn)確率在10%至38%之間。盡管dCas9–SSAP的敲入產(chǎn)量與最佳Cas9參考文獻(xiàn)相似，但dCas9-SSAP產(chǎn)生的誤差最小，并且在整個(gè)基因組基因座中實(shí)現(xiàn)了90-99%的準(zhǔn)確率。

圖10 Workflow (11) and results (12) of the measurement of the cell-fitness effect, defined by the percentage of live cells after editing (normalized to the mock controls). Statistical analyses and comparisons were performed using a Student’s t-test; *P<?0.05; ***P<?0.001; n=?5 biologically independent experiments. MESL, maximum edit site likelihood. Asterisks next to gene names indicate that the insertion site is within the transcription unit of the gene.

圖(11) and results (12) of the measurement of the cell-fitness effect, defined by the percentage of live cells after editing (normalized to the mock controls). Statistical analyses and comparisons were performed using a Student’s t-test; *P<?0.05; ***P<?0.001; n=?5 biologically independent experiments. MESL, maximum edit site likelihood. Asterisks next to gene names indicate that the insertion site is within the transcription unit of the gene.

圖13 Summary of the knock-in accuracy of the dCas9–SSAP editor in comparison with the Cas9 HDR and Cas9 MMEJ methods. Accuracy is defined as the overall yield (%) of correct knock-in in all edited outcomes (correct knock-in, knock-in with indels and NHEJ indels). NGS, next-generation sequencing.

四、通過供體設(shè)計(jì)和細(xì)胞類型對(duì)dCas9–SSAP的評(píng)估。

作為評(píng)估基準(zhǔn)，作者使用了野生型和基于缺口的Cas9（nCas9）編輯器，包括三個(gè)HDR增強(qiáng)工具。作者檢測(cè)了它們?cè)谌齻€(gè)基因組靶標(biāo)上的1kb敲入活性。比較證明dCas9–SSAP實(shí)現(xiàn)了比Cas9、nCas9 和nCas9-hRAD51缺口酶編輯器更高的效率，其效率水平與兩種已發(fā)表的HDR增強(qiáng)編輯器Cas9-HE51和Cas9-GEM52相似（圖14）。作者還將dCas9–SSAP與作者以前的SSAP增強(qiáng)的野生型Cas9工具進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)與引入DNA切割時(shí)相比，基于dCas9的編輯器具有強(qiáng)大但降低的活性，此外，作者的數(shù)據(jù)顯示，單sgRNA dCas9-SSAP編輯器足以進(jìn)行有效的敲入，當(dāng)使用兩個(gè)gRNA時(shí)有微小的提高。

圖14? Comparison of the knock-in efficiencies of dCas9–SSAP and other alternative Cas9, nCas9 and HDR-enhancing tools. Cas9-HE, CtIP-fusion Cas9; Cas9-Gem, Geminin-fusion Cas9; nCas9, Cas9-D10A nickase reference; and nCas9-hRAD51, an improved Cas9 nickase editor. The same donor templates as those used in Fig. 1 were used. Statistical analyses and comparisons were performed using a Student’s t-test; *P<?0.05 and **P<?0.01.

接下來，作者用不同的供體DNA設(shè)計(jì)測(cè)試了dCas9–SSAP編輯器（圖15）。作者首先測(cè)試了HA長(zhǎng)度對(duì)dCas9–SSAP效率的影響（圖16）。作者的結(jié)果表明，當(dāng)使用HDR時(shí)，SSAP介導(dǎo)的編輯比MMEJ供體更有效，并且較長(zhǎng)的HA通常導(dǎo)致更高的編輯效率（圖1f和補(bǔ)充注釋）。這與之前的報(bào)道一致，即MMEJ依賴于DNA斷裂，而DNA斷裂在dCas9編輯中缺失。然后，當(dāng)敲入序列長(zhǎng)度變化時(shí)，作者評(píng)估了dCas9–SSAP的編輯效率，雙熒光蛋白敲入的長(zhǎng)度高達(dá)2kb（圖17）。作者的數(shù)據(jù)顯示，無論轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)度如何，dCas9–SSAP的表現(xiàn)始終如一，其效率與文獻(xiàn)報(bào)道的Cas9相當(dāng)，而且往往更高（圖17）。

此外，作者檢查了dCas9–SSAP編輯器是否可以應(yīng)用于模型人胚胎腎293T（HEK293T）細(xì)胞系以外的其他細(xì)胞類型。作者將dCas9–SSAP應(yīng)用于三種具有不同組織來源的細(xì)胞系（宮頸來源的HeLa細(xì)胞、肝來源的HepG2細(xì)胞和骨來源的U2OS細(xì)胞）。作者在所有三種細(xì)胞上觀察到與Cas9參考相當(dāng)?shù)那萌胄省＝酉聛?，作者使用dCas9–人類胚胎干細(xì)胞（hESCs）中的SSAP編輯器，以在更具治療相關(guān)性的環(huán)境中設(shè)計(jì)序列。

圖15? Design of knock-in donors with different transgene lengths.? ?

圖16? Gene-editing efficiencies at the DYNLT1 (left) and HSP90AA1 (right) loci in HEK293T cells for three types of donor designs with different HA lengths.

圖17 Gene-editing efficiencies at the DYNLT1 (left) and HSP90AA1 (right) loci in HEK293T cells for three types of donor designs with different HA lengths. Knock-in efficiencies for different transgene lengths using the dCas9–SSAP editors. Donor-HA lengths of approximately 200?bp (DYNLT1) and 300?bp (HSP90AA1) were used; n=?2 biologically independent experiments.

作者在所有三個(gè)目標(biāo)上都觀察到了穩(wěn)定的敲入編輯（圖18）。為了避免來自供體DNA的背景，用短HA（約200bp）進(jìn)行干細(xì)胞編輯，并且在沒有選擇的情況下實(shí)現(xiàn)了約3%的千個(gè)堿基量級(jí)的編輯效率。dCas9–SSAP的效率通常與Cas9相當(dāng)或高于Cas9。因此，作者得出結(jié)論，dCas9–SSAP與基于Cas9的編輯器具有相似的效率水平。

圖18?Knock-in gene editing in hESC (H9) cells using the dCas9–SSAP editor. The knock-in efficiencies of the Cas9, Cas9 HDR and dCas9–SSAP editors (e; n=?2 biologically independent experiments).

五、dCas9–SSAP效率優(yōu)化旨在穩(wěn)定的敲入編輯。

作者進(jìn)一步優(yōu)化了dCas9–SSAP編輯器，并在更大的基因組靶點(diǎn)中測(cè)試了其活性。作者首先檢查了劑量的調(diào)整是否可以提高編輯效率（圖19）。當(dāng)作者增加SSAP編碼質(zhì)粒的量時(shí)，作者觀察到所有靶標(biāo)的編輯效率都更高（圖19）。這種相關(guān)性進(jìn)一步支持了插入編輯是由SSAP驅(qū)動(dòng)的。相反，供體數(shù)量的增加對(duì)引入效率的影響可以忽略不計(jì)，這表明供體劑量在這種情況下不是瓶頸。除了劑量?jī)?yōu)化外，作者還延長(zhǎng)了供體HA的長(zhǎng)度，并觀察到HA的進(jìn)一步延長(zhǎng)有助于提高引入效率，這與早期的結(jié)果一致。

使用這些優(yōu)化的參數(shù)，作者測(cè)量了dCas9–SSAP在七個(gè)內(nèi)源性基因座（DYNLT1、HSP90AA1、ACTB、BCAP31、HIST1H2BK、CLTA和RAB11A；圖20）。囊括兩個(gè)基因座（CLTA和RAB11A），其中敲入標(biāo)簽直接融合在內(nèi)源性蛋白質(zhì)的N末端，補(bǔ)充2A肽設(shè)計(jì)。在所有靶點(diǎn)中，dCas9–SSAP在沒有選擇的情況下表現(xiàn)出高達(dá)約20%的效率，這與參考文獻(xiàn)中Cas9相當(dāng)，有時(shí)也略高（圖20）。

圖19?Knock-in efficiencies for SSAP-dosage optimization. Donor-HA lengths of approximately 200?bp (DYNLT1), 300?bp (HSP90AA1) and 200?bp (ACTB) were used; n=?3 biologicallyindependent experiments.

圖20 Performance (knock-in efficiency) of the dCas9–SSAP editor compared with Cas9 references across seven endogenous loci in HEK293T cells after SSAP-dosage optimization and donor-HA extension. Donor-HA lengths of 673?bp?+?750?bp for HSP90AA1, 500?bp?+?800?bp for ACTB, 608?bp?+?740?bp for BCAP31, 212?bp?+?413?bp for HIST1H2BK, 705?bp?+?602?bp for CLTA, 464 bp?+?440?bp for RAB11A and approximately 200?bp for DYNLT1 were used. All knock-in donors targeted the carboxy termini of the endogenous proteins, except for the CLTA and RAB11A donor?which targeted the N termini. The error bars represent the s.e.m. of n=?3 biologically independent experiments.

為了確保dCas9–SSAP介導(dǎo)的編輯在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性，作者接下來檢查了敲入轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持久性。作者在轉(zhuǎn)染dCas9–SSAP和供體DNA后的第3天對(duì)mKate+細(xì)胞進(jìn)行了分類，然后檢查轉(zhuǎn)基因是否在不同基因組基因座的三天窗口期后保持表達(dá)（圖21）。與作者顯示準(zhǔn)確靶點(diǎn)編輯的測(cè)序結(jié)果一致，作者觀察到敲入盒的表達(dá)在dCas9–SSAP遞送后的第5、7和10天是穩(wěn)定的（圖21）。與對(duì)照組相比，敲入細(xì)胞群體具有明顯、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因此，這些數(shù)據(jù)為dCas9–SSAP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定敲入編輯的實(shí)用性提供了支持。

圖21 ?Long-term stability of transgene expression at HSP90AA1 (left) and ACTB (right) post sorting on Day 3 after dCas9–SSAP knock-in. Variable sorting efficiencies led to different starting mKate+ rates .

最后，作者試圖從功能上驗(yàn)證dCas9–SSAP編輯器在內(nèi)源性基因座插入不同有效載荷的能力（圖22）。簡(jiǎn)言之，作者構(gòu)建了具有選擇性有效載荷的敲入供體（嘌呤霉素抗性盒和blasticidin抗性盒）作為與內(nèi)源性基因的融合蛋白（圖23）。作者使用蛋白質(zhì)印跡檢查了dCas9–SSAP和Cas9參考編輯器的敲入結(jié)果。免疫印跡證實(shí)了在靶點(diǎn)（HSP90AA1和ACTB）和有效載荷上使用dCas9–SSAP的預(yù)期敲入融合蛋白的存在和正確大?。▓D23）。此外，作者使用功能分析量化了dCas9–SSAP和Cas9的相對(duì)敲入效率（圖24）。

圖22? Design of the genomic puromycin- and blasticidin-resistance-cassette?knock-in assay to validate functional on-target editing by dCas9-SSAP.??

圖23 Immunoblotting confirmation of the presence and sizes of on-target dCas9–SSAP knock-in products at the HSP90AA1 and ACTB loci, performed with antibody to V5, which recognizes in-frame fusion with endogenous protein. Data are representative of n=?3 biologically independent experiments. Schematics (not to scale) of the knock-in proteins are shown (left).

圖24 Validation and quantification of on-target knock-in using dCas9–SSAP via colony formation assays. Cells were selected by the knock-in resistance cassettes, stained with crystal violet and quantified.

作者采用短HA供體將抗性盒插入內(nèi)源性基因座，并應(yīng)用嘌呤霉素選擇敲入細(xì)胞。使用這種蛋白質(zhì)測(cè)定方法，克隆形成成功地驗(yàn)證了dCas9–SSAP編輯器的穩(wěn)定性（圖24）。

六、dCas9–SSAP對(duì)內(nèi)源性途徑的依賴性（不做重點(diǎn)展示）。

回顧一下作者的模型，dCas9–SSAP在沒有DNA切割的情況下進(jìn)行基因編輯。為了更好地理解dCas9–SSAP編輯的性質(zhì)，作者使用了三種正交化學(xué)擾動(dòng)來檢查其對(duì)內(nèi)源性途徑的依賴性。

作者使用化學(xué)微干擾的技術(shù)手段，證明了dCas9–SSAP編輯的假設(shè)機(jī)制：RNA引導(dǎo)的dCas9與基因組靶標(biāo)結(jié)合，并使其可被SSAP訪問，SSAP在不需要DNA斷裂的情況下促進(jìn)同源定向插入（圖1）。對(duì)這一過程的更深入理解將需要進(jìn)一步的研究，例如，dCas9–SSAP編輯器的生物物理分析、調(diào)節(jié)基因組可及性和修復(fù)途徑的進(jìn)一步分析。

七、最大限度地減少dCas9–SSAP大小,便于遞送。

最后，為了優(yōu)化dCas9–SSAP編輯器便于以后的應(yīng)用，作者試圖開發(fā)一個(gè)與病毒載體（如AAV20,21）的大小限制兼容的最小版本?；诙?jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，作者設(shè)計(jì)了14種不同的截?cái)郣ecT SSAP（圖25），并與全長(zhǎng)對(duì)照一起測(cè)試了它們的基因編輯活性。作者鑒定了一種短RecT變體（長(zhǎng)度約200個(gè)氨基酸），其效率與最初的基于全長(zhǎng)RecT的設(shè)計(jì)相當(dāng)（圖26）。

圖25 Predicted secondary structure and priming sites for constructing truncated EcRecT protein.??

圖26 Relative knock-in efficiencies of the truncation designs. All groups were normalized to the Cas9 references (individually for each target). aa, amino-acid residue.

然后，作者將這個(gè)短SSAP與更緊湊的SaCas9系統(tǒng)和更小的N22 BoxB適體集成，以構(gòu)建最小的dSaCas9–mSSAP編輯器（圖26）。這使作者能夠?qū)SaCas9–mSSAP裝配到單個(gè)AAV中，并使用≤4kb的供體AAV進(jìn)行長(zhǎng)序列編輯（圖26）。作者通過AAV2顆粒的遞送測(cè)試了dSaCas9–mSSAP編輯器，并證實(shí)其在HEK293T細(xì)胞中具有與全長(zhǎng)版本相當(dāng)?shù)男剩▓D28）。這種設(shè)計(jì)雖然需要進(jìn)一步的體內(nèi)驗(yàn)證，但可以為提供dCas9–SSAP編輯器提供一個(gè)方便的選擇。

圖27???Schematic of the dSaCas9–mSSAP system in AAV construct??

圖28 ?Schematic of the dSaCas9–mSSAP system in AAV construct using the compact SaCas9 and its knock-in (800?bp) efficiencies at AAVS1 and HSP90AA1 using in vitro delivery of AAV2 vectors carrying the original and minimized dSaCas9–SSAP editors in HEK293T cells.

篇尾語

與經(jīng)典的Cas9技術(shù)相比較，dCas9–SSAP基因編輯效率相當(dāng)，但具有優(yōu)良準(zhǔn)確度。更重要的是，其dCas9為D10A和H840A突變體，主打一個(gè)cleavage-free，對(duì)基因的損傷更低，一定程度上提升了基因治療在基礎(chǔ)科研和臨床應(yīng)用上最重要的安全性，彌補(bǔ)了現(xiàn)有基因編輯技術(shù)的不足。dSaCas9–mSSAP可以搭載在AAV載體載體上，具有較大的臨床潛力。它是一種有價(jià)值的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無切割基因編輯工具，還有進(jìn)一步改進(jìn)的空間。