如果沒(méi)有限制性內(nèi)切酶，當(dāng)今的分子生物學(xué)研究會(huì)是個(gè)什么樣子？
今天就帶大家來(lái)好好了解一下這個(gè)默默推動(dòng)著許多基礎(chǔ)生物學(xué)研究和商業(yè)化應(yīng)用的幕后成員-限制性內(nèi)切酶以及與它相關(guān)的酶切實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用；
一、什么時(shí)限制性內(nèi)切酶
限制性內(nèi)切酶是一種能夠識(shí)別雙鏈DNA 分子中特定核苷酸序列，并在特定位置切割 DNA 鏈中的磷酸二酯鍵的一類酶；另外每個(gè)限制性內(nèi)切酶會(huì)識(shí)別特定的 DNA 序列，其可在識(shí)別序列內(nèi)或距識(shí)別序列不遠(yuǎn)的位置處切割 DNA。識(shí)別序列長(zhǎng)度通常為 4 - 8 bp，酶切之后會(huì)形成粘性末端（5′ 或 3′ 突出端）或平末端；
根據(jù)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度、作用方式與輔因子的區(qū)別，限制性內(nèi)切酶可分為四大類：
其中Type I酶在原核生物自我保護(hù)不受外源DNA入侵中扮演著重要角色，Type II酶由于自身特點(diǎn)儼然成為分子克隆各種研究應(yīng)用的?？停琓ype III因其基本無(wú)法產(chǎn)生完全切割的片段導(dǎo)致無(wú)人問(wèn)津，而Type IV只能對(duì)甲基化的DNA進(jìn)行切割一般用于檢測(cè)基因組DNA甲基化分析；
除此之外，我們還根據(jù)識(shí)別位點(diǎn)和切割特異性，還可以作另外一種分類：同裂酶、異裂酶、同尾酶；
二、酶切實(shí)驗(yàn)
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既然已經(jīng)對(duì)內(nèi)切酶有初步的了解，我們可以好好開(kāi)始利用它做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)了，目前已經(jīng)有超過(guò)600種限制性內(nèi)切酶廣泛生產(chǎn)和使用，對(duì)于如何選擇所需的內(nèi)切酶，要根據(jù)酶切的目的、識(shí)別位點(diǎn)、緩沖體系等去考慮；
1、內(nèi)切酶的選擇
一般而言，酶切實(shí)驗(yàn)分為單酶切、雙酶切和多酶切；在進(jìn)行雙酶切或多酶切時(shí)，需要注意不同內(nèi)切酶所使用的緩沖溶液是否沖突導(dǎo)致活性受影響、最佳反應(yīng)條件；
以AflIII、ApaLI、PvuII、BsaBI為例：
不難發(fā)現(xiàn)ApaLI、PvuII,2個(gè)酶的反應(yīng)溫度是37℃，但BsaBI卻是60℃，雖然BsaBI、ApaLI、PvuII在CutSmart以及NEB 2.1兩種buffer中的活性都是100%，但因?yàn)榉磻?yīng)溫度不同，所以BsaBI無(wú)法與ApaLI或者PvuII作為雙酶切反應(yīng)的內(nèi)切酶組合；
而AflIII與PvuII在NEB 3.1的buffer中活性為100%，但ApaLI的活性僅10%,所以AflIII與ApaLI無(wú)法雙酶切反應(yīng)的內(nèi)切酶組合；
2、反應(yīng)體系及程序
當(dāng)進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)時(shí)，為確保最佳的反應(yīng)條件，務(wù)必要遵守限制性內(nèi)切酶供應(yīng)商提供的建議。在此過(guò)程中需要考慮的重要參數(shù)包括：底物(DNA) 和酶的量、反應(yīng)體積以及孵育時(shí)間；
以雙酶切反應(yīng)為例：
Buffer：若為10x則加入2ul,若為5x則加入4ul；
內(nèi)切酶：1U，指一個(gè)酶活力單位，不同內(nèi)切酶規(guī)格不一樣，請(qǐng)根據(jù)所購(gòu)買的品牌換算；
（規(guī)格20000U/ml，0.05ml，換算后4U/ul，可加入0.5ul或1ul）
按照上表配制完反應(yīng)體系后，根據(jù)內(nèi)切酶最佳反應(yīng)溫度進(jìn)行孵育（一般為37℃，30min~1h；若使用的是快切酶，孵育時(shí)間可縮短到5~15min；一切以內(nèi)切酶供應(yīng)商提供使用說(shuō)明為準(zhǔn)）；
經(jīng)過(guò)孵育后，可選擇加入配套的Loading buffer（一般含有EDTA，螯合Mg2+）或使用高溫（80℃，內(nèi)切酶失活）中止反應(yīng)，再進(jìn)行凝膠電泳。
二、結(jié)果分析
1.完全酶切
下面我們將以質(zhì)粒載體的雙酶切反應(yīng)為例，詳細(xì)地分析酶切反應(yīng)及其凝膠電泳的結(jié)果：
由于質(zhì)粒載體的序列是已知的，在不存在甲基化或者片段缺失的情況下，所選擇的兩種限制性內(nèi)切酶所產(chǎn)生的切割圖譜是唯一的；
所選的兩種內(nèi)切酶，ApaLI與EcoRV所產(chǎn)生的切割圖譜應(yīng)為：1246bp,1960bp,3993bp,5058bp；
由凝膠電泳圖可見(jiàn)，切割圖譜泳道產(chǎn)生了符合預(yù)期大小的4個(gè)DNA片段，且無(wú)任何雜帶或拖帶、抹帶現(xiàn)象，酶切反應(yīng)成功。
2.不完全酶切
不完全酶切是在限制性內(nèi)切酶使用過(guò)程中常遇到的問(wèn)題之一。當(dāng)酶量過(guò)多或過(guò)少時(shí)，都可能發(fā)生不完全酶切。DNA 樣本中存在污染物也可能導(dǎo)致不完全酶切。緩沖液組分、孵育時(shí)間和反應(yīng)溫度等欠佳的反應(yīng)條件是不完全酶切的常見(jiàn)原因。
部分限制性內(nèi)切酶需要輔因子才能實(shí)現(xiàn)完全活性。例如，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而 Eco57I (AcuI) 需要 S-腺苷甲硫胺酸。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限制性內(nèi)切酶需要兩個(gè)拷貝的識(shí)別位點(diǎn)才能實(shí)現(xiàn)有效切割；針對(duì)這一類酶，通常向反應(yīng)物之中添加一份帶有識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸來(lái)增強(qiáng)酶活性。
除了反應(yīng)條件和酶性質(zhì)外，DNA 自身的性質(zhì)也會(huì)影響限制性酶切。甲基化的 DNA 可耐受部分限制性內(nèi)切酶的切割。酶的識(shí)別位點(diǎn)過(guò)于接近終端（線性底物 DNA 中）以及切割位點(diǎn)相鄰（雙酶切）都可能影響酶切割 DNA 的效率）。此外，部分超螺旋 DNA 分子要比線性 DNA 分子更難切割，增加 5-10 倍的酶量可有助實(shí)現(xiàn)完全酶切。
由凝膠電泳圖可見(jiàn)，第2泳道為第1泳道（質(zhì)粒）的切割圖譜泳道除了產(chǎn)生了符合預(yù)期大小的3個(gè)DNA片段，還出現(xiàn)一個(gè)大小接近原質(zhì)粒大小的DNA片段，這種現(xiàn)象即為酶切不完全。
3.預(yù)料之外的切割圖譜
①由檢測(cè)過(guò)程而非酶切過(guò)程造成的：部分限制性內(nèi)切酶（例如，F(xiàn)okI，TauI）可能會(huì)與 DNA 緊密結(jié)合，導(dǎo)致電泳時(shí)出現(xiàn)明顯的凝膠遷移。使用含 SDS 的上樣染料，加熱使酶從切割的 DNA 上解離開(kāi)來(lái)，均可避免出現(xiàn)這類凝膠遷移現(xiàn)象。
②星號(hào)活性和甲基化也會(huì)導(dǎo)致凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)預(yù)料外的條帶：其中星號(hào)活性是限制性內(nèi)切酶的一種固有性質(zhì)，即在非最優(yōu)反應(yīng)條件下，限制性內(nèi)切酶可能會(huì)作用于與其天然識(shí)別位點(diǎn)存在細(xì)微差異的識(shí)別序列。
例如EcoRI 可以識(shí)別和切割位點(diǎn) 5’-GAATTC-3’，但其星號(hào)活性可能導(dǎo)致序列在 5’-TAATTC-3’ 和 5’-CAATTC-3’ 處被切割。同樣，BamHI 除了可切割其正常的識(shí)別序列 5’-GGATCC-3’ 外，還可切割 5’-NGATCC-3’、5’-GPuATCC-3’ 和 5’-GGNTCC-3’（其中 N 代表任意核苷酸）。
二、注意事項(xiàng)
1.為確保限制性內(nèi)切酶的有效活性，應(yīng)按照制造商的建議妥善存儲(chǔ)并在過(guò)期前使用。通常情況下，應(yīng)將酶分成小等份，存儲(chǔ)在–20?C 條件下的無(wú)霜冰箱之中，從而在維持活性的同時(shí)最大限度避免反復(fù)凍融；
2. 用于酶切的DNA 樣本應(yīng)避免接觸可能抑制酶并造成其它負(fù)面效應(yīng)的污染物，如核酸酶、鹽、有機(jī)溶劑（例如，苯酚、氯仿或乙醇）以及洗滌劑；
3. 為避免在–20°C 條件下結(jié)冰，限制性內(nèi)切酶往往采用 50% 的甘油溶液形式提供。但甘油自身的粘度可能導(dǎo)致反應(yīng)配制階段移液和少量酶加樣較為困難。最好是最后添加酶至終體積，添加之后就充分混勻。“用手指輕彈反應(yīng)管”輕柔混勻，然后短暫離心反應(yīng)管，可幫助酶在反應(yīng)混合物中充分?jǐn)U散，并在反應(yīng)管底部收集到反應(yīng)溶液；
4. 在孵育過(guò)程中，反應(yīng)須達(dá)到所需的溫度，并在整個(gè)孵育期間保持恒定，同時(shí)須格外謹(jǐn)慎地密封反應(yīng)管以避免樣本蒸發(fā)，導(dǎo)致結(jié)果受影響。
