空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)追蹤-第四期
? ? ? ? 本期我們來(lái)介紹一下經(jīng)過(guò)10x Genomics公司升級(jí)后的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)。
? ? ? ? 升級(jí)后的產(chǎn)品稱為“10x Genomics Visium空間基因表達(dá)解決方案”
一、Visium芯片的更新
? ? ? ? 10x Genomics Visium空間基因表達(dá)解決方案同原始產(chǎn)品相同，是兩種芯片，即組織優(yōu)化芯片Tissue Optimization Slide和文庫(kù)構(gòu)建芯片Library Preparation Slide。
其中Library Preparation Slide芯片上有4個(gè)捕獲區(qū)域（6.5 x 6.5 mm），每個(gè)捕獲區(qū)域里有4992個(gè)被特異條形碼barcode標(biāo)記的spot，spot的直徑為55 μm的點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)中含有數(shù)百萬(wàn)個(gè)捕獲標(biāo)簽，相鄰兩點(diǎn)之間中心到中心的距離為100 μm。
? ? ? ? 這里需要明確的是每個(gè)spots能覆蓋1-10個(gè)細(xì)胞，因而空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)并非是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)。它是以一個(gè)sopt為單位的，捕獲的幾個(gè)細(xì)胞中基因表達(dá)的總和。
?捕獲標(biāo)簽的序列結(jié)構(gòu)為：
1）部分測(cè)序引物結(jié)合序列（Partial Read1）；
2）18bp的Spatial Barcode；
3）7bp的umi序列和末尾的Poly(dT)VN序列；
二、組織優(yōu)化流程
? ? ? ? TO芯片包含8個(gè)捕獲區(qū)域，可同時(shí)設(shè)置7個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)條件（8個(gè)中一個(gè)需設(shè)置為陰性對(duì)照）。將組織切片放置在TO芯片上后，進(jìn)行不同的透化時(shí)間處理（3、6、12、18、24、30、36 min），總流程為：固定-染色-明場(chǎng)拍照-組織透化-cDNA合成-組織移除-熒光掃描步驟，完成組織優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷最優(yōu)的透化時(shí)間，小鼠小腸樣本最優(yōu)透化時(shí)間為24 min。
? ? ? ? 同時(shí)我們也可以看到不同物種不同組織的透化時(shí)間也是不同的，因而每種樣本在文庫(kù)構(gòu)建之前都必須進(jìn)行組織優(yōu)化，確定最優(yōu)條件以獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
三、文庫(kù)構(gòu)建流程
? ? ? ? 正式文庫(kù)構(gòu)建的步驟為：1.組織切片放置在LP芯片上；2.固定；3.染色；4.明場(chǎng)拍照；5.透化；6.cDNA合成；7.第二鏈cDNA合成；8.變性；9.循環(huán)數(shù)確定；10.cDNA擴(kuò)增；11.純化和質(zhì)控；12.片段化，末端修復(fù)，加A；13.連接頭；14.樣本index PCR。最后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。
? ? ? ? 那么以上就是10x Genomics升級(jí)后的流程了，由于較原流程去掉了體外轉(zhuǎn)錄和過(guò)夜反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，大大縮減了實(shí)驗(yàn)操作的時(shí)間，由3天縮減到1天，從而更加符合產(chǎn)品的商業(yè)化要求，為大規(guī)模的科研應(yīng)用甚至以后的臨床診斷產(chǎn)品的研發(fā)打下了基礎(chǔ)。
? ? ? ? 歡迎對(duì)此技術(shù)感興趣的同仁可以留言跟我一起討論~?
? ? ? ? 后續(xù)的幾期內(nèi)容，我們將結(jié)合發(fā)表的空間轉(zhuǎn)錄組文獻(xiàn)來(lái)思考一下該技術(shù)的研究思路是什么，如何講一個(gè)完整的story！
「2019年11月01日 ·北京」
