在真核生物信號依賴性轉(zhuǎn)錄的經(jīng)典模型中，結(jié)合DNA的激活性蛋白調(diào)節(jié) RNA 聚合酶Ⅱ (Pol Ⅱ) 向一組靶向啟動子的募集。 然而，最近的研究以及我們在此的結(jié)果表明，在特定的信號傳導(dǎo)事件之前，Pol Ⅱ廣泛分布（即“預(yù)加載 preloaded”）在許多基因的啟動子處。 Pol Ⅱ 募集和 Pol Ⅱ 預(yù)加載如何適應(yīng)統(tǒng)一的基因調(diào)控模型尚不清楚。 此外，細(xì)胞信號激活哺乳動物基因組中預(yù)載的 Pol Ⅱ 的機制仍然很大程度上未知。 我們在這里表明，雌激素信號傳導(dǎo)的主要基因組結(jié)果是靶基因啟動子處 Pol Ⅱ活性的招募后調(diào)節(jié)，可能是通過 Pol Ⅱ 磷酸化的特定變化而不是通過將 Pol Ⅱ 招募到啟動子。此外，我們還發(fā)現(xiàn)負(fù)調(diào)控延伸因子與預(yù)載的 Pol Ⅱ結(jié)合到雌激素靶啟動子上，并抑制基因表達(dá)，直到收到適當(dāng)?shù)男盘枴Ｗ詈?，我們的研究表明，預(yù)載 Pol Ⅱ 的雌激素依賴性激活促進了快速的基因調(diào)節(jié)反應(yīng)，這在調(diào)節(jié)雌激素信號傳導(dǎo)本身方面發(fā)揮著重要的生理作用。 我們的結(jié)果揭示了雌激素信號通路對招募后 Pol Ⅱ調(diào)節(jié)的廣泛應(yīng)用，這種調(diào)節(jié)模式可能適用于多種信號調(diào)節(jié)通路。

基因表達(dá)調(diào)控是細(xì)胞響應(yīng)生理和環(huán)境信號的重要手段。 在信號依賴性轉(zhuǎn)錄的經(jīng)典模型下，DNA 結(jié)合激活蛋白促進 RNA 聚合酶 Ⅱ(Pol Ⅱ)募集到一組目標(biāo)啟動子。 另一種非相互排斥的控制基因表達(dá)的機制涉及 Pol Ⅱ 活性的調(diào)節(jié)，主要通過磷酸化，在招募到靶基因后的一個步驟。在后生動物中，基因特異性研究提供了受 Pol Ⅱ 招募或 Pol Ⅱ 招募后激活調(diào)節(jié)的基因的例子，盡管主要機制仍然很大程度上未知。此外，最近的全基因組研究表明，Pol Ⅱ 在特定信號事件之前定位于許多未表達(dá)基因的啟動子（即 Pol Ⅱ 是“預(yù)加載的”）。有趣的是，預(yù)加載或停滯的 Pol Ⅱ 最近被認(rèn)為在調(diào)節(jié)啟動子-近端核小體組裝和基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。

目前關(guān)于預(yù)載 Pol Ⅱ在整個基因組中的作用的假設(shè)表明，它隨時可以被生理或發(fā)育信號激活。這一假設(shè)的有效性以及特定信號通路激活預(yù)載 Pol Ⅱ的機制尚未在全基因組范圍內(nèi)直接研究。雌激素，如 17β-雌二醇 (estradiol, E2)，是信號調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的良好模型，因為它們通過 DNA 結(jié)合雌激素受體 (ER) 發(fā)揮作用，控制涉及生殖、發(fā)育和代謝的基因表達(dá)模式。 E2 信號傳導(dǎo)基因激活的歷史模型是基于 E2 調(diào)節(jié)基因模型開發(fā)的，涉及 E2 依賴性染色質(zhì)修飾，然后招募 Pol Ⅱ 來靶向啟動子。然而，這種“Pol Ⅱ招募”模型的普遍性尚未在整個 E2 調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組中得到檢驗。

轉(zhuǎn)錄周期的復(fù)雜性為精細(xì)調(diào)控 Pol Ⅱ 依賴性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)提供了許多機會。 在轉(zhuǎn)錄起始之前，PolⅡ 與基因啟動子處的通用轉(zhuǎn)錄因子形成起始前復(fù)合物 (PIC) 。啟動后，Pol Ⅱ 從啟動子中釋放，通過基因編碼區(qū)進入生產(chǎn)性延伸。 Pol Ⅱ Rpb1亞基羧基末端結(jié)構(gòu)域（通常稱為 Pol Ⅱ CTD）七肽重復(fù)序列中特定殘基的磷酸化標(biāo)志著從轉(zhuǎn)錄起始到轉(zhuǎn)錄延伸的轉(zhuǎn)變。例如，Pol Ⅱ CTD 的絲氨酸 5 處的磷酸化(Ser5P) 通常發(fā)生在轉(zhuǎn)錄周期的早期。 相反，絲氨酸2 的磷酸化(Ser2P) 主要由正轉(zhuǎn)錄延伸因子-b (P-TEFb) 的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 9 (Cdk9) 催化，通常與生產(chǎn)性延伸同時發(fā)生，并且主要朝向基因的 3' 末端。負(fù)延伸因子 (NELF) 和 DRB 敏感性誘導(dǎo)因子(DSIF) 復(fù)合物等反式作用因子協(xié)同抑制轉(zhuǎn)錄延伸，它們的負(fù)面影響可以通過 P-TEFb 克服。然而，最近的研究表明 NELF 也可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮積極作用。Pol Ⅱ磷酸化以及 NELF 和 DSIF 的功能如何在基因組規(guī)模上受細(xì)胞信號調(diào)節(jié)仍然很大程度上未知。

在本研究中，我們表明人類基因組中很大一部分未表達(dá)的基因（約 20%）在特定信號事件之前已預(yù)加載 Pol Ⅱ。 此外，我們的研究表明，靶啟動子處雌激素信號傳導(dǎo)的主要基因組結(jié)果是預(yù)載 Pol Ⅱ 的募集后激活，可能是通過CTD 的磷酸化，而不是 Pol Ⅱ 的募集。 該過程涉及依賴 E2 的 Cdk9 招募。 此外，我們的結(jié)果表明，交易調(diào)節(jié)因子（例如 NELF 和 DSIF）可通過預(yù)加載的 Pol Ⅱ 抑制轉(zhuǎn)錄，直到收到適當(dāng)?shù)男盘枺ɡ?E2）。 E2 的這種調(diào)節(jié)模式促進了快速的基因調(diào)節(jié)反應(yīng)，該反應(yīng)在前饋途徑中發(fā)揮作用來調(diào)節(jié)整個雌激素信號傳導(dǎo)程序。 本文描述的結(jié)果與其他最近的發(fā)現(xiàn)一起揭示了一種信號依賴性基因調(diào)控的新模式，該模式可能適用于多種信號調(diào)控途徑。

1. Pol Ⅱ 占據(jù)不一定與基因表達(dá)相對應(yīng)

為了探索人類細(xì)胞中信號調(diào)控轉(zhuǎn)錄的整體機制，我們使用 ChIP 與基因組微陣列（即 ChIP-chip）結(jié)合來確定 Pol Ⅱ 在基礎(chǔ)條件下 MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞中~18,900個啟動子處的定位，在無雌激素的生長條件。 使用嚴(yán)格的call peak標(biāo)準(zhǔn)和較低的錯誤發(fā)現(xiàn)率，我們發(fā)現(xiàn) Pol Ⅱ 與 chip 上大約一半（即 8,678個）啟動子的 TSS 結(jié)合并在 TSS 處形成peak（參見補充材料中的圖 S1A），與之前的結(jié)果一致。 接下來，我們使用一式三份的微陣列分析將 Pol Ⅱ 結(jié)合數(shù)據(jù)與其中 14,000 個啟動子的表達(dá)信息進行匹配。 根據(jù)我們的標(biāo)準(zhǔn)，在所有三個重復(fù)中具有“存在”調(diào)用的基因被定義為明確“表達(dá)”，而在所有三個重復(fù)中具有“不存在”調(diào)用的基因被定義為明確“未表達(dá)”。 微陣列分析中表達(dá)狀態(tài)不明確的基因被排除在進一步考慮之外。 通過 qRT-PCR 確認(rèn)了幾個“表達(dá)”和“未表達(dá)”基因的表達(dá)狀態(tài)（參見補充材料中的圖 S2）。 當(dāng)然，我們對明確“未表達(dá)”的定義并不排除從我們研究中分析的啟動子中表達(dá)低水平或未注釋的轉(zhuǎn)錄本的可能性，這些轉(zhuǎn)錄本逃避了微陣列的檢測。 盡管如此，它提供了一個有用的工作定義。

使用這些嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，我們在基礎(chǔ)無雌激素生長條件下的 MCF-7 細(xì)胞中鑒定出了 5,104 個明確“表達(dá)”和 3,632 個明確“未表達(dá)”基因（參見補充材料中的圖S1B）。 正如預(yù)期的那樣，大多數(shù)表達(dá)基因在其啟動子處含有 Pol Ⅱ（表達(dá) Pol+ ），而大多數(shù)未表達(dá)基因則缺乏 Pol Ⅱ（未表達(dá) Pol- ）（圖 1A ）。 然而，令人驚訝的是，PolⅡ 結(jié)合基因的一個子集在測試條件下沒有表達(dá)（未表達(dá)的 Pol+；圖 1A ）。 這些發(fā)現(xiàn)表明，目標(biāo)啟動子上 Pol Ⅱ 的負(fù)載不一定與基因表達(dá)或 Pol Ⅱ 活性相關(guān)。

2. 未表達(dá)基因處預(yù)載的 Pol Ⅱ 可以進行轉(zhuǎn)錄起始

未表達(dá)基因啟動子處的 Pol Ⅱ 可能與作為 PIC 一部分的一般轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。在這種情況下，Pol Ⅱ Rpb1 亞基的 CTD 在七肽重復(fù)序列的Ser2 和 Ser5 處應(yīng)大部分未磷酸化?；蛘?，Pol Ⅱ 可能在啟動后/延伸階段的早期暫停于啟動子近端，無法進展到有效延伸狀態(tài)。在這種情況下，Pol Ⅱ Rpb1 亞基的 CTD 應(yīng)優(yōu)先在Ser5 位點磷酸化，而不是在 Ser2 位點磷酸化 （圖 1C）。?

為了探索這兩種與我們的 Pol Ⅱ 啟動子結(jié)合結(jié)果相關(guān)的可能性，我們使用特異性識別 Pol Ⅱ CTD 的 Ser5 磷酸化(Ser5P) 形式的抗體進行了 ChIP-chip （圖 1B）。 正如預(yù)期的那樣，Ser5P 在與 Pol Ⅱ 結(jié)合一致的表達(dá)基因的 TSS 處達(dá)到峰值（Pol+），而在未表達(dá)的 Pol 基因的 TSS 處檢測到很少的Ser5P（圖 1B，頂部和中間）。 未表達(dá)的 Pol+（即“預(yù)加載”）基因啟動子處的 Ser5P 狀態(tài)可用于將基因分為兩個不同的組——大約三分之二的基因在啟動子處顯示很少的 Ser5P（Ser5P；可能代表 PIC 結(jié)合啟動子），而其余基因在 TSS 處顯示 Ser5P 峰值（Ser5P；可能代表 Pol Ⅱ 在早期延伸階段暫停） （圖1D）。 這些結(jié)果表明，未表達(dá)基因啟動子上預(yù)加載的 Pol Ⅱ 可能處于轉(zhuǎn)錄前啟動階段或早期延伸階段。與這一觀察結(jié)果一致，基因特異性 ChIP 分析揭示了未表達(dá)的 Pol+ Ser5P- 和未表達(dá)的 Pol+ Ser5P+ 基因的 TSS 處存在Pol Ⅱ和 TFⅡB，但不存在于下游1 kb 區(qū)域（圖 1E ）。

3.?大多數(shù)雌激素調(diào)控的啟動子在 E2 處理之前加載有 Pol Ⅱ

盡管目前的模型表明預(yù)載 Pol Ⅱ 的招募后激活在信號調(diào)節(jié)基因表達(dá)中發(fā)揮作用，但尚未在基因組上研究特定細(xì)胞信號在招募后調(diào)節(jié) Pol Ⅱ 活性的程度。 為了在高等真核生物中探索這一點，我們研究了雌激素（一種發(fā)育和生理上重要的信號分子）調(diào)節(jié) Pol Ⅱ 占據(jù)和目標(biāo)啟動子活性的機制。 首先，我們通過對經(jīng)過或未經(jīng) 3 小時 E2 處理的 MCF-7 細(xì)胞進行表達(dá)微陣列分析，確定了雌激素信號傳導(dǎo)的靶基因。 該分析揭示了560 個基因的表達(dá)在 E2?處理后發(fā)生了顯著變化； 291 種受到刺激，269 種受到抑制，這一發(fā)現(xiàn)與之前的報道一致（圖 2A）。

接下來，為了確定這些 E2 調(diào)節(jié)基因的啟動子上的 Pol Ⅱ 占據(jù)情況，我們在經(jīng)過或不經(jīng)過 45 分鐘 E2 處理的 MCF-7 細(xì)胞中對 Pol Ⅱ 進行了ChIP-chip（圖 2B）。 我們使用了簡短的 E2 處理，以便于檢測直接效應(yīng)，而不是次要效應(yīng)。 令人驚訝的是，與以往認(rèn)知的 E2 配體 ER 激活基因的“Pol Ⅱ 募集”模型相反，大多數(shù)（291 個中的 171 個 [59%]）E2 刺激基因在E2 處理前其啟動子的Pol Ⅱ 水平升高（包括兩個研究最深入的哺乳動物“暫停的 Pol Ⅱ”基因，MYC 和FOS?；圖 2B，頂部）。 在 E2 處理后，這些水平要么增加（即 Pol Ⅱ 預(yù)結(jié)合并進一步招募），要么保持不變（即 Pol Ⅱ 預(yù)結(jié)合并保持不變）（統(tǒng)稱為“Pol Ⅱ 預(yù)加載”基因）（圖 2C 和 D）。 對于 E2抑制基因組也觀察到類似的趨勢，其中大多數(shù)在 E2 處理之前和之后都含有 Pol Ⅱ（圖 2B 底部和 C）。 我們將剩余的研究重點放在調(diào)節(jié) E2 依賴性基因激活的機制上，這些機制比 E2 依賴性基因抑制更容易理解。 在 E2 處理之前，通過對所選靶基因進行核 run-on 分析證實了 Pol Ⅱ 預(yù)加載基因的啟動子上存在 Pol Ⅱ（參見補充材料中的圖 S4）。

我們的基因表達(dá)和 Pol Ⅱ ChIP-chip 結(jié)果表明，對于大多數(shù) E2 調(diào)節(jié)的基因，Pol Ⅱ 在啟動子占據(jù)的變化不足以解釋 E2 處理后基因表達(dá)的變化。 在這方面，所有“組成型”Pol Ⅱ 預(yù)加載基因（總共 171 個中的 126 個）在 E2 處理后表現(xiàn)出表達(dá)顯著增加，而其啟動子處的 Pol Ⅱ 占用率沒有顯著增加（圖 2D）。 我們目前的研究使用包含所有 RefSeq 啟動子的微陣列平臺，對包含預(yù)裝載 Pol Ⅱ 的 E2 調(diào)控啟動子的百分比提供了比我們之前的研究更高的估計 (24)， 這可能是由于我們之前的研究中使用了較小、有偏向的微陣列平臺。

4.?在 E2 刺激的情況下，預(yù)載的 Pol Ⅱ 會移動到基因體內(nèi)

在 E2 刺激之前，E2 響應(yīng)基因的啟動子上存在預(yù)加載的 Pol Ⅱ，這表明 E2 信號在招募后調(diào)節(jié) Pol Ⅱ 的活性中發(fā)揮作用。 例如，E2 可以通過促進 Pol Ⅱ 轉(zhuǎn)錄延伸到基因體內(nèi)。 為了測試這一點，我們針對 ChIP-chip 研究中發(fā)現(xiàn)的所有 E2 刺激的 Pol Ⅱ 預(yù)載基因，將 TSS 處的 Pol Ⅱ 占用率與下游區(qū)域的 Pol Ⅱ 占用率進行了比較（有或沒有 E2 刺激）。 在 E2處理之前，下游 Pol Ⅱ 占用率顯著低于TSS 處的占用率(P=2 × 10e7 )（圖 3A，左）。 E2 處理后，下游的 Pol Ⅱ 占用率增加至與TSS 處觀察到的相似水平（圖 3A，右），表明 E2 處理促進預(yù)載 Pol Ⅱ 通過基因的移動。 為了驗證這些結(jié)果，我們通過 ChIP-qPCR 分析了 ChIP-chip 實驗中鑒定的 12 個 E2 刺激基因的 TSS 和下游1-kb區(qū)域中 Pol Ⅱ 的占據(jù)情況（圖 3B 和 C，數(shù)據(jù)未顯示）。 這些實驗證實了 ChIP-chip 的結(jié)果，并表明E2 刺激的基因可以根據(jù)其啟動子上 Pol Ⅱ 結(jié)合的調(diào)節(jié)分為兩大類：(i) Pol Ⅱ 預(yù)加載型基因 (n = 171)，其中 Pol Ⅱ 是 在 E2 處理之前主要存在于 TSS，并在 E2 處理后進入基因體內(nèi)（例如 CYP1B1、MYC、CEBPB、SIAH2、PMAIP1、FOS、MDM2 和 STC2；圖 3B 和未顯示的數(shù)據(jù)）；? (ii) Pol Ⅱ 招募型基因 (n = 42)，其中 Pol Ⅱ 在 E2 處理之前不存在，并在激活后被募集（例如，TFF1、GREB1、KRT13 和 HOXC5；圖 3C 和數(shù)據(jù)未顯示）。 我們的 ChIP-chip 和基因特異性研究表明，在大多數(shù)情況下，E2 通過調(diào)節(jié) Pol Ⅱ 的活性而不是招募來控制靶基因表達(dá)。

5.?E2 刺激預(yù)載 Pol Ⅱ 的磷酸化

為了探索 E2 信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié) Pol Ⅱ 活性的機制，我們通過 ChIP-qPCR 確定了 E2 對 E2 靶基因上 Pol Ⅱ CTD 磷酸化的影響。 在 E2 處理之前，TSS 處預(yù)載的 Pol Ⅱ 在Ser5 處被磷酸化，但 Ser2 幾乎沒有磷酸化（圖 4A 和 B）。E2處理后，PolⅡ預(yù)加載和Pol Ⅱ募集基因的TSS和下游區(qū)域的Ser5P和Ser2P增加，表明Ser5/Ser2磷酸化的Pol Ⅱ通過該基因的移動（圖4A和B）。 這些結(jié)果與我們之前的研究結(jié)果一致 (24)，并對其進行了擴展，表明在 E2 處理之前，預(yù)加載的 Pol Ⅱ 可能會啟動轉(zhuǎn)錄，但無法進入生產(chǎn)性延伸。 此外，他們認(rèn)為 E2 誘導(dǎo)的 Pol Ⅱ 磷酸化（主要是 Ser2P）是刺激預(yù)載 Pol Ⅱ 延伸活性的觸發(fā)器。

為了進一步研究 E2 如何刺激 Pol Ⅱ 的磷酸化和延伸活性，我們分析了 Cdk9 在 E2 刺激基因的 TSS 和 +1-kb 區(qū)域的定位。Cdk9是 P-TEFb 的一個亞基，是主要負(fù)責(zé) Pol Ⅱ CTD 中 Ser2 磷酸化以及生產(chǎn)性延伸的激酶 。 有趣的是，Cdk9 以 E2 依賴性方式被招募到 E2 刺激的基因中，對于大多數(shù)基因，Cdk9 在+1-kb區(qū)域的占據(jù)率較高，這一發(fā)現(xiàn)與其與 Pol Ⅱ 一起通過基因移動的能力一致 (圖4C)。 在這方面，DRB 對 Pol Ⅱ 激酶（例如 Cdk9）活性的抑制阻斷了代表性 Pol Ⅱ 預(yù)加載和 Pol Ⅱ 募集基因的 E2 依賴性誘導(dǎo) （例如 CYP1B1 和 TFF1；參見補充材料中的圖 S5）。 總的來說，我們的研究結(jié)果提供了將 E2 信號傳導(dǎo)與 Cdk9 招募、Pol Ⅱ?CTD 磷酸化和 E2 刺激基因的轉(zhuǎn)錄激活聯(lián)系起來的證據(jù)。

6.?NELF 與 Pol Ⅱ 預(yù)載啟動子結(jié)合并在 E2 刺激之前抑制基因表達(dá)

除了調(diào)節(jié) E2 誘導(dǎo)的 Pol Ⅱ 激活的機制之外，我們還研究了在 E2 處理之前阻止預(yù)加載的 Pol Ⅱ 通過基因體轉(zhuǎn)錄的機制。 NELF 和 DSIF 復(fù)合體是兩個共調(diào)節(jié)因子，它們合作抑制轉(zhuǎn)錄延伸并在啟動子處建立暫停的 Pol Ⅱ 。 因此，我們研究了 NELF 和 DSIF 在 E2 調(diào)節(jié)啟動子處預(yù)載 Pol Ⅱ 的調(diào)節(jié)中的潛在作用。 我們在用 ChIP-chip 進行 E2 處理之前測定了 NELF-A 亞基與 E2 刺激的啟動子的結(jié)合，如上面針對 Pol Ⅱ 的描述一樣。 有趣的是，我們觀察到NELF-A 與預(yù)加載 Pol Ⅱ 的大多數(shù)啟動子結(jié)合，但很少有 NELF-A 與招募的 Pol Ⅱ 啟動子結(jié)合（圖 5A），這一發(fā)現(xiàn)與我們之前的研究一致（24）。 基因特異性 ChIP 測定證實了這些結(jié)果，并揭示了DSIF 的?Spt5 亞基的類似結(jié)合模式（圖 5B，參見補充材料中的圖 S6）。 E2處理后，NELF-A和Spt5仍然與這些基因的啟動子相關(guān)，盡管E2依賴性Cdk9募集和Pol Ⅱ磷酸化（圖4）足以克服NELF和DSIF的負(fù)面影響并允許Pol Ⅱ 通過基因轉(zhuǎn)錄。 總之，我們的結(jié)果表明，在Pol Ⅱ 磷酸化和 E2信號激活之前，NELF 和 DSIF 參與了 E2 刺激基因啟動子處預(yù)載 Pol Ⅱ 的負(fù)調(diào)節(jié)。 他們還表明，NELF 和 DSIF 雖然仍與啟動子相關(guān)，但在 E2 刺激后無法消除其負(fù)面影響。

為了進一步了解 NELF 在 E2 依賴性 Pol Ⅱ 激活中的作用，我們在MCF-7 細(xì)胞中敲低了 NELF-B，這是一種已被證明與 ER 相互作用的 NELF 亞基。 有趣的是，NELF-B 的敲低也導(dǎo)致 NELF-A 和 NELF-E 蛋白水平降低，這可能是由于整個 NELF 復(fù)合物的不穩(wěn)定所致（圖 5C）。 為了研究 NELF 消耗對 E2 調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響，我們測定了經(jīng)過或不經(jīng)過 3 小時 E2 處理的幾個 Pol Ⅱ 募集和Pol Ⅱ 預(yù)載基因的mRNA 水平（圖 5D 和 E）。 NELF耗盡對Pol Ⅱ招募基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄或E2反應(yīng)沒有重大影響（圖5D），但確實增加了Pol Ⅱ預(yù)載基因的基礎(chǔ)基因表達(dá)水平，這一發(fā)現(xiàn)與NELF 防止預(yù)加載的 Pol Ⅱ 在 E2 處理之前轉(zhuǎn)錄基因一致（圖 5E）。 有趣的是，NELF 耗盡對 E2 刺激后的基因表達(dá)沒有重大影響，證實了我們的假設(shè)，即 NELF 盡管存在，但在 E2 依賴性 Pol Ⅱ 磷酸化和Cdk9 招募后無法繼續(xù)維持其負(fù)面影響（圖 5F）。

7.?Pol Ⅱ 預(yù)載基因比 Pol Ⅱ 招募基因更容易受到 E2 的刺激

目前的假設(shè)表明，預(yù)載 Pol Ⅱ 的招募后激活在響應(yīng)生理和環(huán)境信號的基因快速誘導(dǎo)中具有重要的生物學(xué)作用。 在這方面，我們發(fā)現(xiàn)Pol Ⅱ招募和Pol Ⅱ預(yù)載基因在不同的基因功能類別中富集（圖6）。 例如，Pol Ⅱ 預(yù)載的基因在可能期望快速誘導(dǎo)的功能類別中富集（例如，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)），而 Pol Ⅱ 招募的基因在其他功能類別（例如，發(fā)育）中富集。

為了進一步探討這一點，我們檢查了 Pol Ⅱ 預(yù)加載基因和 Pol Ⅱ 招募基因之間E2 依賴性誘導(dǎo)動力學(xué)是否存在差異。MCF-7細(xì)胞用E2處理0、1、3和6小時，并通過定量RT-PCR測量許多E2刺激基因的mRNA水平（圖7A和B）。 平均而言，E2 刺激 Pol Ⅱ 預(yù)載基因的速度明顯快于 Pol Ⅱ 招募基因的刺激速度（P = 0.001），前者在 E2處理后 1 小時達(dá)到峰值，后者在 E2 處理后 3 小時達(dá)到峰值（圖 7C）。 與這些基因表達(dá)結(jié)果一致，與招募到 TFF1 基因的 Pol Ⅱ 相比，預(yù)加載的Pol Ⅱ 更快地移動到 CYP1B1 基因體內(nèi)（參見補充材料中的圖 S7）。 盡管Pol Ⅱ預(yù)加載和募集后激活與更快速的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相關(guān)，但處理3小時后的絕對 E2 誘導(dǎo)在PolⅡ預(yù)加載和Pol Ⅱ募集基因之間沒有差異（圖7D）。 有趣的是，我們檢查的許多 Pol Ⅱ 預(yù)載基因在增強（例如 MYC、CEBPB 和 SIAH2）或減弱（例如 CYP1B1 和 MDM2）E2 信號傳播方面發(fā)揮著重要作用（參見討論）（圖 7E）。 總而言之，我們的結(jié)果表明，在招募后水平上細(xì)胞信號對 Pol Ⅱ 的調(diào)節(jié)可能會促進即時反應(yīng)，從而有助于細(xì)致地進行信號反應(yīng)調(diào)節(jié)。

討論

在這項研究中，我們使用基因組和基因特異性檢測來檢查 Pol Ⅱ 在基礎(chǔ)生長條件下整個基因組啟動子的結(jié)合和調(diào)節(jié)，以及對 E2 信號傳導(dǎo)的反應(yīng)。 我們的結(jié)果表明：（i）Ser5 磷酸化的Pol Ⅱ 廣泛分布在許多未表達(dá)基因的啟動子上，在 E2 信號傳導(dǎo)之前，（ii）E2 信號傳導(dǎo)的主要基因組結(jié)果是通過磷酸化對 Pol Ⅱ 活性進行招募后調(diào)節(jié)，(iii) NELF 通過預(yù)載Pol Ⅱ 抑制轉(zhuǎn)錄延伸，直至接收到 E2 信號，并且 (iv) 預(yù)載 Pol Ⅱ 的 E2 依賴性激活促進快速基因調(diào)控反應(yīng)，這在調(diào)節(jié)雌激素信號傳導(dǎo)本身中發(fā)揮重要的生理作用。 這些研究超出了我們之前的工作 (24)，我們之前的工作使用了有限數(shù)量的啟動子 (~1,000) 的較小的微陣列平臺，包括在其他實驗室進行的先前研究中鑒定的一組有偏差的 E2 調(diào)節(jié)基因。 總的來說，我們的結(jié)果建立了一種新的 E2 依賴性基因調(diào)控模式，該模式可能適用于多種信號調(diào)控途徑。

許多未表達(dá)的基因在其啟動子處預(yù)載了 Pol Ⅱ。 我們的結(jié)果表明，人類基因組中大部分（~20%）未表達(dá)基因的啟動子在特定信號事件之前已預(yù)加載 Pol Ⅱ（圖 1C）。 對于這些基因中的約三分之二，預(yù)加載的 Pol Ⅱ 保留在?PIC 中，而對于其余基因，預(yù)加載的 Pol Ⅱ 已啟動轉(zhuǎn)錄，如 Ser5P 所示，但無法進行生產(chǎn)性延伸（圖 1D）。 我們的結(jié)果與其他研究一致表明在特定信號事件之前，Pol Ⅱ 廣泛分布在許多未表達(dá)基因的啟動子處，盡管這些預(yù)載 Pol Ⅱ 的Ser5P 狀態(tài)以前沒有研究過。 目前的假設(shè)表明，未表達(dá)基因上預(yù)載的 Pol Ⅱ 在適當(dāng)?shù)臅r間被某些生理或發(fā)育信號激活。 盡管這一假設(shè)已在基因特異性研究中得到檢驗，但仍需要一種全基因組方法來評估特定信號通路 Pol Ⅱ 招募后激活的普遍性和機制。

雌激素信號通過磷酸化激活預(yù)載的 Pol Ⅱ。 目前 E2 和其他信號通路的信號依賴性轉(zhuǎn)錄模型重點關(guān)注 Pol Ⅱ 向目標(biāo)啟動子的信號依賴性招募。 這種“Pol Ⅱ 募集”模型是基于信號調(diào)節(jié)基因的有限子集開發(fā)的，其通用性尚未在整個 E2 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組中得到檢驗。 最近的研究以及此處描述的結(jié)果表明，在特定信號事件之前，Pol Ⅱ 廣泛分布在基因啟動子處，但特定的細(xì)胞信號激活預(yù)載 Pol Ⅱ 此前尚未在全基因組范圍內(nèi)研究過。

在這里，我們顯示大多數(shù) E2 刺激的基因 (59%) 預(yù)載有 Pol Ⅱ，在 E2 處理之前，Pol Ⅱ 主要保留在 TSS 中，并在 E2 處理后移動到基因體內(nèi)（圖 3）。 Pol Ⅱ 的這種運動與 E2 依賴性 Pol Ⅱ 磷酸化（主要是 Ser2P）以及 Cdk9 招募同時發(fā)生（圖 4）。 因此，DRB 對 Pol Ⅱ 激酶活性（例如 Cdk9）的抑制消除了 E2 刺激基因的誘導(dǎo)（參見補充材料中的圖 S5）。 大多數(shù) E2 刺激基因的編碼區(qū)中 Cdk9 的占據(jù)率較高，這一發(fā)現(xiàn)與其與 Pol Ⅱ 一起穿過該基因的能力一致。 總之，我們的結(jié)果與 E2 刺激的 Cdk9 募集和 Pol Ⅱ 磷酸化的直接轉(zhuǎn)錄作用一致。 但請注意，DRB 也已被證明具有非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)（例如，干擾 RNA 加工）。

Cdk9 的 E2 依賴性募集提供了一種通過 E2 信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié) Pol Ⅱ 依賴性轉(zhuǎn)錄的新方法。 Cdk9 與細(xì)胞周期蛋白 T 結(jié)合形成 P-TEFb，它磷酸化 Pol Ⅱ CTD 的Ser2、 DSIF 和 NELF，從而允許暫停的Pol Ⅱ 進入生產(chǎn)性延伸。 一個問題是 E2 處理后 Cdk9 被招募到基因中的機制。 有趣的是，細(xì)胞周期蛋白 T 已被證明與 ERα 相互作用，并可能負(fù)責(zé)將 Cdk9 招募到 E2 刺激的基因 。 另一種機制可能涉及含有溴結(jié)構(gòu)域的蛋白 BRD4，該蛋白通過與乙酰化組蛋白的相互作用介導(dǎo) P-TEFb 與人類基因的關(guān)聯(lián) 。 總的來說，我們的結(jié)果擴展了 E2 信號共調(diào)節(jié)因子的列表，除了經(jīng)過充分研究的轉(zhuǎn)錄起始因子之外，還包括對轉(zhuǎn)錄延伸重要的因子。

NELF?在 E2 刺激之前而不是之后介導(dǎo)其負(fù)延伸效應(yīng)。 我們的研究表明，NELF 和 DSIF 在 E2 處理之前與大多數(shù) Pol Ⅱ 預(yù)載啟動子結(jié)合，但在相同條件下幾乎不與招募 Pol Ⅱ 的啟動子結(jié)合（圖 5A 和 B）。 這些結(jié)果與 NELF 和 DSIF 在基因 5' 端建立暫停的 Pol Ⅱ 中的作用一致。 但有趣的是，E2 處理后，NELF 和 DSIF 仍與 Pol Ⅱ 預(yù)載基因的啟動子相關(guān)，這表明，雖然啟動子釋放了 NELF 和 DSIF，但 Pol Ⅱ 的 E2 依賴性激活并未發(fā)生。 一種可能性是，E2 依賴性 Pol Ⅱ 磷酸化足以通過使 Pol Ⅱ CTD 易于接觸、結(jié)合延伸因子來克服 NELF 和 DSIF 的負(fù)面影響 。 與這一假設(shè)一致，我們的 NELF 敲低研究表明，NELF 在 E2 處理之前抑制 Pol Ⅱ 預(yù)載基因的表達(dá)，但在 E2 依賴性 Pol Ⅱ 磷酸化和 Cdk9 招募后無法介導(dǎo)其負(fù)面影響，即使 NELF 仍然在啟動子處（圖5E）。 另一種可能性是NELF 通過 Cdk9 磷酸化而失活，如體外所示（17），盡管尚未在體內(nèi)進行探索。 第三種可能性是 NELF 和 DSIF 與啟動子的持續(xù)關(guān)聯(lián)是由于與重新啟動的 Pol Ⅱ 的重新關(guān)聯(lián)。 在未來的研究中測試這些和其他可能性將會很有趣。

Aiyar 等人之前研究過 NELF 在配體調(diào)節(jié)的 E2 靶基因激活中的作用，重點關(guān)注招募 Pol Ⅱ 的基因（例如 TFF1，也稱為 pS2）。 他們發(fā)現(xiàn)，在 NELF-B（也稱為 COBRA1）耗盡后，TFF1 的基礎(chǔ)表達(dá)和 E2 誘導(dǎo)的表達(dá)都會增加，并得出結(jié)論，COBRA1 會導(dǎo)致 Pol Ⅱ 在 TFF1 的啟動子近端區(qū)域暫停。 這一結(jié)果與我們的觀察結(jié)果明顯矛盾，即 NELF-B 耗盡對 TFF1 和其他“Pol Ⅱ 招募”基因的表達(dá)沒有重大影響。 一種可能的解釋是 Aiyar 等人他們使用 T47D 細(xì)胞進行實驗，而我們使用 MCF-7 細(xì)胞。 NELF-B 缺失對 TFF1 表達(dá)的影響可能是細(xì)胞類型特異性的，不同乳腺癌細(xì)胞系中雌激素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)模式也是如此 。 有趣的是，T47D細(xì)胞中的基礎(chǔ)?TFF1?表達(dá)遠(yuǎn)低于 MCF-7 細(xì)胞中的基礎(chǔ)?TFF1?表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示），可能 NELF 和其他負(fù)調(diào)節(jié)復(fù)合物可能在 T47D 的 TFF1 調(diào)節(jié)中比 MCF-7 細(xì)胞發(fā)揮更大作用。

Pol?Ⅱ 的招募后調(diào)節(jié)可實現(xiàn)快速的基因調(diào)節(jié)反應(yīng)和可能的自我調(diào)控。 先前的研究表明，預(yù)載 Pol Ⅱ 的招募后激活在響應(yīng)生理和環(huán)境信號的基因快速誘導(dǎo)中具有重要的生物學(xué)作用 。 我們的動力學(xué)分析表明，E2 刺激 Pol Ⅱ 預(yù)載基因的速度明顯快于 Pol Ⅱ 募集基因（圖 7C）。 這些結(jié)果基于mRNA 水平的穩(wěn)態(tài)測量，與直接轉(zhuǎn)錄效應(yīng)一致，但也可能包括對 mRNA 穩(wěn)定性和周轉(zhuǎn)率的影響。 有趣的是，我們在分析中發(fā)現(xiàn)的許多 E2 刺激的 Pol Ⅱ 預(yù)載基因在調(diào)節(jié) E2 信號通路中發(fā)揮著重要作用。例如，MYC、CEBPB?和 FOS 基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子與 ERα 配合調(diào)節(jié)次要靶標(biāo)，從而傳播 E2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖 7E）。 此外，編碼泛素連接酶的 SIAH2 通過靶向核輔阻遏物 NCoR 并使其被蛋白酶體快速降解，有助于全基因組傳播雌激素信號反應(yīng)。 然而，并非所有快速刺激的 Pol Ⅱ 預(yù)載基因都能以積極的方式調(diào)節(jié) E2 信號傳導(dǎo)。 例如，CYP1B1 編碼細(xì)胞色素 P450 單加氧酶，可代謝 E2，并且可能是控制靶組織中 E2 水平的快速代謝反饋調(diào)節(jié)的一部分。 此外，MDM2 編碼一種泛素連接酶，參與 E2 處理后蛋白酶體快速降解 ERα。 之前已經(jīng)針對一系列細(xì)胞信號描述了靶基因正向和負(fù)向自動調(diào)節(jié)的類似例子，包括絲裂原激活蛋白激酶、NF-κB、轉(zhuǎn)化生長因子 β 和 STAT 調(diào)節(jié)途徑。 在我們檢查的 Pol Ⅱ 招募基因組中，這種自動調(diào)節(jié)功能并不明顯。 總的來說，我們的結(jié)果以及之前的研究表明，Pol Ⅱ 作為細(xì)胞信號通路終點的 招募后調(diào)節(jié)可能會促進快速反應(yīng)，從而有助于細(xì)胞信號本身的精確調(diào)節(jié)。

Kininis M, Isaacs GD, Core LJ, Hah N, Kraus WL. Postrecruitment regulation of RNA polymerase II directs rapid signaling responses at the promoters of estrogen target genes. Mol Cell Biol. 2009 Mar;29(5):1123-33.