RNA-seq能夠更加詳細(xì)地刻畫(huà)不同病理或生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄組的改變?；赗NA-seq數(shù)據(jù)在不同狀態(tài)間進(jìn)行差異表達(dá)基因的識(shí)別是研究疾病機(jī)制以及臨床應(yīng)用的主要手段。
流程參考了生物信息課堂上老師給的文檔。
數(shù)據(jù)參考文章https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50177
數(shù)據(jù)選了兩個(gè)進(jìn)行試驗(yàn)：SRR957677 SRR957678
軟件篇：
1.Aspera：一款高速傳輸軟件，可以幫助我們快速下載序列文件（安裝教程參考這篇文章http://www.itdecent.cn/p/19dcff88a1eb）
wget https://download.asperasoft.com/download/sw/connect/3.6.2/aspera-connect-3.6.2.117442-linux-64.tar.gz
tar -zvxf aspera-connect-3.6.2.117442-linux-64.tar.gz
sh aspera-connect-3.6.2.117442-linux-64.sh
~/.aspera/connect/bin/ascp -h
2.安裝R語(yǔ)言，在R語(yǔ)言中安裝DESeq2，用DESeq2進(jìn)行基因表達(dá)差異分析（參考文章http://www.itdecent.cn/p/4d0812195b65）
sudo apt install r-base-core
R
#進(jìn)入R語(yǔ)言包
> source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
>biocLite("DESeq2")
3.hisat2：比對(duì)基因組工具
wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/downloads/hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip
unzip hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip
echo 'export PATH=~/hisat2:$PATH'>>~/.bashrc
source ~/.bashrc
4.BWA：序列比對(duì)軟件
wget https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/bwa-0.7.15.tar.bz2
tar -jxvf bwa-0.7.15.tar.bz2
cd bwa-0.7.15
make
5.Samtools：samtools是一個(gè)用于操作sam和bam文件的工具合集（安裝參考http://www.itdecent.cn/p/0e05b471189f）。
6.htseq-count利用 htsep-count 計(jì)算比對(duì)到每個(gè)基因的短序列數(shù)目（安裝參考http://www.itdecent.cn/p/5750e8e6fd7e）
7.fastp: 一款超快速全功能的FASTQ文件自動(dòng)化質(zhì)控，過(guò)濾，校正，預(yù)處理軟件，可參考fastp說(shuō)明文件 https://github.com/OpenGene/fastp
conda install -c bioconda fastp
1.數(shù)據(jù)獲取
利用Aspera下載原始數(shù)據(jù)時(shí)（語(yǔ)句如下
wget anonftp@ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov:/sra/srainstant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR957/SRR957677/SRR957677.sra）出現(xiàn)下圖問(wèn)題：
加參數(shù) -P 33011還是同樣的問(wèn)題，利用
prefetch SRR957677同樣顯示via http....，最后只好在ENA上找到序列的fastq文件，利用wget下載，唯一問(wèn)題就是速度很慢特別耗時(shí)間。
wget https://www.ncbi.nlm.nih.gov//sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR957/SRR957677/SRR957677.sra
wget https://www.ncbi.nlm.nih.gov//sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR957/SRR957678/SRR957678.sra
速度太慢了，一秒十幾kb，最后復(fù)制ENA上的網(wǎng)址，用迅雷下了，也不是很快一秒一二百kb，總比wget好一點(diǎn)（中間還試了wget anonftp@ftpprivate.ncbi.nlm.nih.gov:/sra/srainstant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR957/SRR957677/SRR957677.sra也沒(méi)成功）。
下載完直接拖進(jìn)MobaXterm文件列表就行。
fastp -i /home/aa/2/SRR957677.fastq.gz -I /home/aa/2/SRR957678.fastq.gz -o SRR957677.clean.fastq -O SRR957678.clean.fastq --trim_front1=5 --trim_front2=5 --trim_tail1=1 --trim_tail2=1 --html -w 1
生成去除低質(zhì)量序列的.clean.fastq 同時(shí)生成可視化文件 fastp.html 可查看各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)。
3.去除重復(fù)性的冗余序列
remove_redunt_pair_fsq.py SRR957677.clean.fastq SRR957678.clean.fastq 1 1unique SRR957677.clean.uniq.fastq SRR957678.clean.uniq.fastq
生成.clean.uniq.fast格式的文件。
4.利用比對(duì)軟件 bwa 將短序列比對(duì)到參考基因組
bwa mem -t 2 -M /home/aa/2/hg19.exons.gtf SRR957677.clean.fastq > SRR957677.sam
bwa mem -t 2 -M /home/aa/2/hg19.exons.gtf SRR957678.clean.fastq > SRR957678.sam
生成sam格式文件。
5.利用 samtools 對(duì) sam 格式的比對(duì)文件進(jìn)行處理，以便進(jìn)行后續(xù)分析。
samtools view -bt /home/aa/2/hg19/hg19.fa.fai -@ 2 -o SRR957677.bam SRR957677.sam 2>>samtools.log
samtools view -bt /home/aa/2/hg19/hg19.fa.fai -@ 2 -o SRR957678.bam SRR957678.sam 2>>samtools.log
為排序后的bam文件建立索引
samtools index SRR957677.sort.bam
samtools index SRR957678.sort.bam
利用samtools對(duì)排序后的bam文件進(jìn)行可視化
samtools tview SRR957677.sort.bam /home/aa/2/hg19/hg19.fa
samtools tview SRR957678.sort.bam /home/aa/2/hg19/hg19.fa
6.利用 htsep-count 計(jì)算比對(duì)到每個(gè)基因的短序列數(shù)目
htseq-count -f sam -s no -t CDS -i ID -m union --nonunique=none --secondary-alignments=ignore -o SRR957677_assigned.sam SRR957677.sam /home/aa/hg19/hg19.gff > SRR957677_expression.counts
htseq-count -f sam -s no -t CDS -i ID -m union --nonunique=none --secondary-alignments=ignore -o SRR957678_assigned.sam SRR957678.sam /home/aa/hg19/hg19.gff > SRR957678_expression.counts
生成文件：SRR957677_expression.counts SRR957678_expression.counts
記錄比對(duì)到每個(gè)基因上的短片段數(shù)目, 代表基因表達(dá)水平的高低。
