上期給大家介紹了T4SS的生物學(xué)功能以及研究方法，Type IV secretion system：T4SS知識(shí)介紹1；T4SS的的底物類(lèi)型及轉(zhuǎn)移方式，Type IV secretion system：T4SS知識(shí)介紹2
今天小編給大家介紹IV分泌系統(tǒng)的四種IV分泌系統(tǒng)研究模型
模型革蘭氏陰性細(xì)菌T4SSs結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系知識(shí)的進(jìn)展
包括類(lèi)似于根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens ）VirB/VirD4 T4SS的“最小化”系統(tǒng)和由幽門(mén)螺桿菌Cag（ Helicobacter pylori Cag），嗜肺軍團(tuán)菌 (Legionella pneumophila) Dot/Icm代表的“擴(kuò)展”系統(tǒng)和F質(zhì)粒編碼的（F plasmid-encoded） Tra T4SS。
根癌土壤桿菌VirB/D system
T4SS最少由一組保守的亞基組成。在革蘭氏陰性菌中，需要約12個(gè)亞基來(lái)構(gòu)建功能齊全的“最小化”系統(tǒng)。根據(jù)來(lái)自典型根癌土壤桿菌VirB/VirD4 T4SS的T4SS超家族的統(tǒng)一命名法，這些被命名為VirB1至VirB11和VirD4。
VirB1 蛋白是一種雙功能蛋白質(zhì)，它一方面可以在 T4SS 裝配位點(diǎn)降解宿主細(xì)胞壁肽聚糖，方便 T4SS 插入宿主細(xì)胞，另一方面，VirB1 通過(guò)與菌毛亞單位的相互作用促進(jìn)菌毛形成；
蛋白VirB 形成一個(gè)菌毛結(jié)構(gòu)的跨膜分泌通道，從細(xì)菌內(nèi)膜延伸跨過(guò)外膜通向胞外環(huán)境。這個(gè)菌毛結(jié)構(gòu)主要由大部分的 VriB2 亞單位和少部分的 VirB5 亞單位共同組成一個(gè)具有完整功能的分泌通道；
蛋白VirB3和VirB7為菌毛相關(guān)蛋白；蛋白VirB6- 10 為跨膜通道的組分，存在于周質(zhì)，內(nèi)膜和外膜中，并形成分泌通道及其輔助蛋白；VirB4，VirB11和VirD4定位于內(nèi)膜并作為為系統(tǒng)供電的ATP酶。
三種ATP酶（VirD4，VirB4，VirB11）構(gòu)成位于易位通道底部的細(xì)胞質(zhì)能量中心。在這些ATP酶中，VirD4在進(jìn)入易位通道之前充當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)底物結(jié)合的受體。蛋白VirB4 和 VirB11 是為轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量的 ATPase；而蛋白 VirD4 是被稱(chēng)為“ 伴侶 蛋白 ” 的另一個(gè) ATPase，它的作用在于將要轉(zhuǎn)運(yùn)的 DNA 呈遞給分泌系統(tǒng)的其他組分。
通道本身由兩個(gè)子組件組成，一個(gè)組件跨越內(nèi)膜（IM），另一個(gè)組件位于周質(zhì)和外膜（OM）中。IM復(fù)合物（IMC）最少由VirB3，VirB6，VirB8和VirB10的N-末端區(qū)域組成。與通道穩(wěn)定結(jié)合的VirB4 ATP酶也被認(rèn)為是IMC的一部分。IMC通過(guò)莖或圓柱體連接到外膜核心復(fù)合物（OMCC），其最小程度地由脂蛋白VirB7，VirB9和VirB10的C末端結(jié)構(gòu)域組成。
嗜肺軍團(tuán)菌Dot/Icm
Dot/Icm系統(tǒng)是目前研究最深入的T4SS之一。TDot/Icm系統(tǒng)已被確認(rèn)存在于嗜肺軍團(tuán)菌和伯納特立克次氏體中。嗜肺軍團(tuán)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，可入侵變形蟲(chóng)，或是人類(lèi)的巨噬細(xì)胞。嗜肺軍團(tuán)菌使用T4SSDot/Icm定殖人肺泡巨噬細(xì)胞，引發(fā)稱(chēng)為退伍軍人病(Legionnaire’s disease)的嚴(yán)重肺炎。4SSDot/Icm在感染期間轉(zhuǎn)移超過(guò)300種蛋白質(zhì)效應(yīng)物，其中許多已顯示靶向控制膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。T4SSDot/Icm還保留了將可移動(dòng)元件的IncQ質(zhì)粒RSF1010轉(zhuǎn)移至受體細(xì)菌的作用。
嗜肺軍團(tuán)菌T4BSS與T4ASS的相似性非常有限，但T4BSS的基本結(jié)構(gòu)與T4ASS相似。T4BSS由大約27個(gè)Dot/icm基因組成，編碼22種結(jié)構(gòu)蛋白和5種與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中效應(yīng)蛋白相互作用的伴侶蛋白。
Dot/Icm T4SS是嗜肺軍團(tuán)菌發(fā)病機(jī)制所必需的關(guān)鍵毒力因子，并將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞質(zhì)中，使嗜肺軍團(tuán)菌能夠操縱多種細(xì)胞過(guò)程，包括膜運(yùn)輸，蛋白質(zhì)合成，泛素化和自噬。
為了逃避宿主的殺死，嗜肺軍團(tuán)菌將吞噬體轉(zhuǎn)化為稱(chēng)為含軍團(tuán)菌液泡（LCV）的保護(hù)隔室，其形成需要T4SSDot/Icm。嗜肺軍團(tuán)菌被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬后，在吞噬體成熟前期， 通過(guò)抑制吞噬體 - 溶酶體融合，因而細(xì)菌不被溶解得以存活。嗜肺軍團(tuán)菌的Dot/Icm T4SS系統(tǒng)將粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和吞噬體構(gòu)成一個(gè)小室，以供細(xì)菌在此大量繁殖，與細(xì)菌毒力密切相關(guān)。此外，嗜肺軍團(tuán)菌的 Dot/Icm T4SS 系統(tǒng)還可促宿主細(xì)胞凋亡以及細(xì)菌從吞噬體中的逃逸。
Dot/Icm系統(tǒng)通道優(yōu)先組裝在嗜肺軍團(tuán)菌細(xì)胞的兩極，實(shí)際上，極性定位對(duì)于T4SS在感染過(guò)程中的功能至關(guān)重要。然而，即使在固定相中生長(zhǎng)的細(xì)胞也具有橫向的Dot/Icm系統(tǒng)。橫向Dot/Icm系統(tǒng)可能對(duì)應(yīng)于組裝中間體。T4SSDot/Icm組裝途徑的是由兩種蛋白質(zhì)DotU和IcmF負(fù)責(zé)T4SSDot/Icm的極性靶向。
通過(guò)透射電鏡觀察、原位冷凍和熒光顯微鏡也進(jìn)一步闡明了OMCC和IMC的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)活動(dòng)。OMCC呈現(xiàn)為由DotC，DotD，DotF，DotG和DotH亞基組成的直徑為400埃的“Wi-Fi”狀結(jié)構(gòu)，而且OMCC在寬度（~400?）上近似于Cag系統(tǒng)，但在高度僅為~165?。它由五個(gè)亞單位組成，其中DotD、DotH和DotG是VirB7、VirB9和VirB10的功能對(duì)應(yīng)物，DotF和DotC是系統(tǒng)特異性的。 在OMC內(nèi)DotC、DotD、DotH、DotK和Lpg0657分別以1:2:1:1:1的化學(xué)計(jì)量比存在。OMC和PR表現(xiàn)出對(duì)稱(chēng)性失配，但在這種情況下OMC具有13重對(duì)稱(chēng)性，周質(zhì)環(huán)（periplasmic ring，PR）具有18重對(duì)稱(chēng)性。DotK和Lpg0657具有類(lèi)似肽聚糖結(jié)合域的折疊，但在兩種蛋白的結(jié)合縫隙中均未觀察到肽聚糖。
IMC主要由IM蛋白DotG、DotF、ATP酶DotO和DotB 構(gòu)成；DotO采用與VirB4相似的二聚體排列的六聚體，DotO呈現(xiàn)為兩個(gè)直徑與由CagE形成的I環(huán)和M環(huán)大致相同的同心環(huán).I環(huán)底部的六聚環(huán)被假定為對(duì)應(yīng)于類(lèi)VirB11的DotB。
the H. pylori Cag T4SS (T4SSCag).
T4SSCag系統(tǒng)主要存在于幽門(mén)螺桿菌中，以在感染期間將底物附著并轉(zhuǎn)移到人胃上皮細(xì)胞中，類(lèi)似于革蘭氏陰性細(xì)菌接合系統(tǒng)和根癌土壤桿菌VirB/VirD4 T4SS，其產(chǎn)生接合菌毛以促進(jìn)附著。
這些底物不僅包括CagA'癌蛋白'，還包括染色體DNA，肽聚糖和D-甘油-b-D-甘露-庚糖1,7二磷酸（D-glycero-b-D-manno-heptose 1,7bisphosphate ，HBP），它是LPS代謝物。
CagA的易位誘導(dǎo)真核靶細(xì)胞的各種變化，包括但不限于細(xì)胞骨架改變和細(xì)胞極性和粘附的變化，細(xì)胞-細(xì)胞連接的破壞以及增加的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞遷移。T4SSCag介導(dǎo)的HBP易位涉及NF-kB途徑的激活，因此HBP被指定為新的病原體相關(guān)分子模式或PAMP。然而，在最近的更新中，幽門(mén)螺旋桿菌顯示產(chǎn)生HBP的水平太低而不能解釋NF-κB活化。相反，HBP的衍生物ADP-甘油-β-D-甘露庚糖（ADP-glycero-β-D-manno-heptose，ADP heptose）被鑒定為負(fù)責(zé)幽門(mén)螺桿菌誘導(dǎo)的人上皮細(xì)胞中NF-κB活化的關(guān)鍵PAMP。
CagA分泌底物位于Cag菌毛的尖端；CagL及其同系物VirB5都定位于各自的菌毛上并且涉及靶細(xì)胞結(jié)合；然而，奇怪的是，產(chǎn)生接合菌毛所需的VirB2菌毛蛋白和VirB10亞基的直系同源物CagC和CagY對(duì)于Cag菌毛是不必要的。據(jù)報(bào)道，幽門(mén)螺桿菌擁有大的鞘管結(jié)構(gòu)，其與Cag菌毛的關(guān)系尚未確定。在接合系統(tǒng)中，沒(méi)有直接證據(jù)表明DNA或蛋白質(zhì)底物在接合菌毛內(nèi)或附著于接合菌毛。因此，與T4SSCag的接合性質(zhì)以及Cag菌毛和鞘管的功能作用仍在研究中。
最近的報(bào)道定義了OMCC的三維結(jié)構(gòu)，分辨率高達(dá)3.4?。OMCC具有三種不同的結(jié)構(gòu)特征，由外層（O層）和內(nèi)層（I層），周質(zhì)環(huán)（periplasmic ring，PR）和莖組成的外膜帽（outer membrane cap，OMC）。最引人注目的是，OMC（14重對(duì)稱(chēng)）和PR（17重對(duì)稱(chēng)）之間存在明顯的對(duì)稱(chēng)失配。OMCC由CagX和CagY各14個(gè)拷貝，CagM和CagT 28個(gè)拷貝和Cag3 70個(gè)拷貝組成，即5種組分（CagX，CagY，CagM，CagT，Cag3）的化學(xué)計(jì)量比為1:1:2:2:5。該結(jié)構(gòu)證實(shí)了CagX和CagY都構(gòu)成OMC和PR的一部分，從而彌合對(duì)稱(chēng)失配的事實(shí)。值得注意的是，T4SSs的兩個(gè)高度保守的核心亞基VirB9和VirB10跨越OMCC的兩部分，在“最小化”系統(tǒng)中具有相同的14倍對(duì)稱(chēng)性，但在T4SSCag中具有14倍和17倍對(duì)稱(chēng)性。
原位CryoET檢測(cè)到的T4SSCag的IMC結(jié)構(gòu)成份。T4SS系統(tǒng)結(jié)構(gòu)有一個(gè)中央通道，CagA和其他底物可能通過(guò)這個(gè)通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。IMC由三個(gè)直徑分別為~12，~22和~36 nm的同心環(huán)組成，分別表示為I環(huán)，M環(huán)和O環(huán)。首先，CagE通過(guò)先組裝成二聚體后形成的六聚體來(lái)對(duì)I環(huán)和M環(huán)進(jìn)行組裝，二聚體有助于I環(huán)和M環(huán)的一部分。其次，類(lèi)似VirB11的Cagα通過(guò)與CagE直接接觸而與I環(huán)的細(xì)胞質(zhì)面穩(wěn)定結(jié)合。類(lèi)似VirD4的Cagβ有助于O環(huán)的形成以及I環(huán)和M環(huán)的細(xì)胞質(zhì)延伸。值得注意的是，這是第一個(gè)可視化的T4SS的ATP酶能量中心，其中所有三種ATP酶都清楚地作出結(jié)構(gòu)貢獻(xiàn)。總體而言，T4SSCag序組裝途徑是有序的，其中OMCC首先組裝，然后成核IMC的整體膜部分的組裝。ATP能量中心通過(guò)由CagE，Cagα和Cagβ在IMC的細(xì)胞質(zhì)基部組裝.最后，一個(gè)或多個(gè)未指明的成分通過(guò)與Cagβ和可能的一個(gè)或兩個(gè)其他ATP酶的接觸進(jìn)行組裝。
F質(zhì)粒編碼的Tra T4SS系統(tǒng)（F plasmid-encoded Tra systems ）
T4ss系統(tǒng)的基本機(jī)理和結(jié)構(gòu)特性的理想模型，易于遺傳操作，目前唯一已知擁有動(dòng)態(tài)延伸和縮回的F菌毛的T4ss。F菌毛是延伸到細(xì)菌細(xì)胞外空間以介導(dǎo)與靶細(xì)胞附著的細(xì)絲。附著后，F(xiàn)菌毛縮回以將兩個(gè)細(xì)胞拉在一起，允許建立直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸，并最終建立SDS-和抗剪切的“交配連接”(SDS- and shear-resistant ‘mating junction’)。先前的研究確定F菌毛由數(shù)千個(gè)作為螺旋組裝體聚合的TraA（菌毛蛋白）分子組成。
對(duì) T4SS 的研究最早始于1946年，Lederburg 和 Fatum 發(fā)現(xiàn)大腸桿菌F質(zhì)粒接合系統(tǒng)。大腸桿菌的 F質(zhì)粒接合系統(tǒng)，參與細(xì)菌遺傳物質(zhì)從供體細(xì)胞到受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
T4SS Conjugation systems
質(zhì)粒是自主復(fù)制位于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)狀DNA分子。四分之一的質(zhì)粒是接合質(zhì)粒，另一個(gè)四分之一對(duì)應(yīng)于可動(dòng)員質(zhì)粒，最后，所有質(zhì)粒的一半是不可移動(dòng)的質(zhì)粒。結(jié)合和可移動(dòng)的質(zhì)粒一起構(gòu)成所謂的可傳播質(zhì)粒。
結(jié)合質(zhì)粒很?。?0–200kb），自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，能夠通過(guò)復(fù)制到另一種細(xì)菌菌株或物種中編碼其轉(zhuǎn)移。
可移動(dòng)質(zhì)粒是攜帶形成全部或部分松弛體所需的DNA轉(zhuǎn)移基因的質(zhì)粒，但缺乏交配孔形成所需的基因
通常，質(zhì)粒提供細(xì)菌存活的有利特性和能力，例如對(duì)殺菌和抑菌抗生素的抗性。根據(jù)不相容性組（Inc）對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行分類(lèi)，使得同一組的兩個(gè)質(zhì)粒不能在同一細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)同時(shí)共存。一些Inc組（例如，IncN，IncP和IncW）可以在許多不同的細(xì)菌物種中發(fā)現(xiàn)；相反，其他（例如，IncF和IncI）只能穩(wěn)定地保存在特定的細(xì)菌物種中）。接合和可移動(dòng)質(zhì)粒分別含有參與綴合過(guò)程的全部或部分基因。
接合相關(guān)基因分為兩個(gè)模塊：MOB（遷移率）和MPF（交配對(duì)形成）基因。接合質(zhì)粒具有兩個(gè)模塊，因此具有編碼HGT所需的所有蛋白質(zhì)的基因。
MOB模塊，以前稱(chēng)為DNA轉(zhuǎn)移和復(fù)制Dtr proteins（DNA transfer and replication proteins），由底物處理所需的三個(gè)序列組成。
首先是oriT（轉(zhuǎn)移起點(diǎn)）序列，它標(biāo)志著DNA加工的起點(diǎn)。
其次，編碼特異性識(shí)別其質(zhì)粒的oriT序列的松弛酶的序列。松弛酶是所有可傳播質(zhì)粒中唯一的保守蛋白。
MOB模塊中編碼的第三種蛋白質(zhì)是T4CP，其識(shí)別細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的松弛體并將其與位于膜中的分泌通道連接。同樣，參與松弛體加工的輔助蛋白也可以在MOB模塊中找到。
另一方面，MPF模塊編碼構(gòu)建T4SS的蛋白質(zhì)（在T4AS的情況下為VirB1-11）。
T4SS 接合系統(tǒng)
A、 T4SS通道，接合菌毛和松弛體的組裝。松弛體（由松弛酶，DNA和輔助蛋白組成）在細(xì)胞質(zhì)中形成
B、 預(yù)起始復(fù)合物的形成（pre-initiation complex）
一旦菌毛，T4SS和松弛體形成，相互作用形成預(yù)起始復(fù)合物，一直保持至接合開(kāi)始。
松弛體由T4CP通過(guò)各種相互作用聚集。盡管已知松弛酶在其T4CP識(shí)別序列中具有轉(zhuǎn)移信號(hào)，T4CP與附著于分泌通道的VirB4產(chǎn)生六聚或異六聚體。DNA與T4CP的結(jié)合以及隨后與T4SS的相互作用似乎觸發(fā)了T4CP和類(lèi)VirB11蛋白對(duì)ATP的水解。這些過(guò)程誘導(dǎo)VirB10的構(gòu)象變化，從而激活分泌通道。
C、 激活接合過(guò)程。
盡管由DNA結(jié)合和ATP水解引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)對(duì)于底物轉(zhuǎn)移是必需的，但也需要細(xì)胞外信號(hào)。當(dāng)菌毛識(shí)別受體細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生該細(xì)胞外信號(hào)。一旦受體菌與，菌毛就會(huì)縮回（F型）或下降（P型），形成兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞之間的連接。此外，由于VirB10蛋白和T4CP之間的一系列相互作用，識(shí)別信號(hào)通過(guò)T4SS轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果，松弛酶切割DNA鏈共價(jià)連接至5'端。此外，DNA復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制的形式發(fā)生，從游離3'端形成DNA鏈。
D、 底物通過(guò)T4SS傳輸。
底物由與ssDNA共價(jià)結(jié)合的松弛酶組成。為了轉(zhuǎn)移具有這種不同特征的復(fù)合物（即蛋白質(zhì)和核酸），T4SS需要在接合期間經(jīng)歷實(shí)質(zhì)性變化。在這個(gè)問(wèn)題上，許多問(wèn)題仍未得到解答，例如，哪個(gè)組件首先轉(zhuǎn)移？松弛酶如何展開(kāi)和轉(zhuǎn)移？根據(jù)轉(zhuǎn)移DNA免疫沉淀（TrIP）測(cè)定，ssDNA從T4CP轉(zhuǎn)移至VirB11而無(wú)需能源成本，然后，將底物轉(zhuǎn)移至VirB6和VirB8蛋白。此時(shí)，ATP酶需要活躍以產(chǎn)生所需的能量；接下來(lái)，底物從VirB8轉(zhuǎn)移到VirB9，最后轉(zhuǎn)移到菌毛中的VirB2。最初，提出了一步和兩步模型。在第一個(gè)模型（一步）中，ssDNA底物將直接轉(zhuǎn)移到T4SS，而在第二個(gè)模型（兩步）中，ssDNA底物將從T4CP通道轉(zhuǎn)移到細(xì)胞周質(zhì)，并從那里轉(zhuǎn)移到T4SS。在任何情況下，由于細(xì)胞周質(zhì)中存在高含量的核酸酶，該第二模型已被丟棄。相反，有人建議將T4CP放置在T4SS的入口處，將底物直接轉(zhuǎn)移到T4SS。已經(jīng)提出了針對(duì)ssDNA底物的三種可能的轉(zhuǎn)移途徑：（i）通過(guò)T4CP六聚體的通道轉(zhuǎn)移至T4SS；（ii）在其被T4CP攝取后，底物可以通過(guò)VirB4六聚體并從那里轉(zhuǎn)移到T4SS；或（iii）在與ATP酶相互作用后，底物可直接通過(guò)IMC亞基形成的通道轉(zhuǎn)移。
參考文獻(xiàn)：
[1] álvarez-Rodríguez I, Arana L, Ugarte-Uribe B, et al. Type IV Coupling Proteins as Potential Targets to Control the Dissemination of Antibiotic Resistance.?Front Mol Biosci. 2020;7:201. Published 2020 Aug 12. doi:10.3389/fmolb.2020.00201
[2] Costa, TRD, Harb, L, Khara, P, Zeng, L, Hu, B, Christie, PJ. Type IV secretion systems: Advances in structure, function, andactivation. Mol Microbiol. 2021; 00: 1– 17.?https://doi.org/10.1111/mmi. 14670
http://weixin.qq.com/r/lziGnqPEFv5pref9922F?(二維碼自動(dòng)識(shí)別)
【猜你喜歡】
2.?Nucleic Acids Research|oriTfinder:細(xì)菌耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移研究工具
3.?Nature Microbiology|耐藥性分析軟件：NanoOK RT package 簡(jiǎn)介
4.?Science l 對(duì)多種耐藥真菌有效的新天然產(chǎn)物的研究
5.?Virulence |第三代頭孢菌素耐藥肺炎克雷伯菌獲得性耐藥研究
6.?Nature reviews microbiology |肺炎克雷伯菌的群體基因組學(xué)研究
7.?Nat Microbiol|噬菌體可使耐藥細(xì)菌恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性
8.?文獻(xiàn)解讀｜JHM：破譯一個(gè)連通的湖泊-河流-水庫(kù)系統(tǒng)中抗生素抗性基因及其非生物指示
9.?綜述｜Nature Reviews Genetics：基于測(cè)序數(shù)據(jù)研究抗菌素抗性的方法和資源
10.?綜述｜Water Research: 環(huán)境中抗生素抗性基因的溯源追蹤--挑戰(zhàn)、進(jìn)展和展望
