2021年11月，Hardikkumar Jetani等在BLOOD上發(fā)表文章“Siglec-6 is a novel target for CAR T-cell therapy in acute myeloid leukemia”，闡述了唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素（siglec）-6成為急性髓系白血?。ˋML）的CAR-T治療靶點(diǎn)的可行性。原文

唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素（Siglec）形成一個(gè)細(xì)胞表面受體超家族，在造血系統(tǒng)中表達(dá)，并與人類免疫細(xì)胞中的抑制性信號傳導(dǎo)有關(guān)。Siglec超家族的成員正在被研究作為嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞免疫療法的靶抗原，包括B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）中的Siglec-2（CD22）和急性髓性白血?。ˋML）中的Siglec-3（CD33）。CD22特異性CAR-T細(xì)胞已在用CD19 CAR-T淋巴細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的B-ALL患者中顯示出臨床活性并再次誘導(dǎo)緩解。CD33特異性CAR-T細(xì)胞已被證明在AML的臨床前模型中有效，并已在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評估，因?yàn)镃D33在AML母細(xì)胞上普遍表達(dá)。然而，靶向CD33也存在挑戰(zhàn)，包括由于CD33在正常造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPCs）上的表達(dá)，預(yù)測正常造血會被消融，以及與大量AML細(xì)胞相比，CD33在AML干細(xì)胞上的表達(dá)較低。AML中CAR-T細(xì)胞還有其他候選抗原，包括CD123和FLT3，它們共同面臨在正常HSPCs以及CLL-1、CD7和葉酸受體β上表達(dá)的挑戰(zhàn)，這些細(xì)胞在AML母細(xì)胞上不均勻表達(dá)，在AML干細(xì)胞上低水平表達(dá)。因此，人們一直在努力鑒定新的靶抗原和相應(yīng)的CAR結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這些抗原在AML中具有潛在的治療作用。

在本研究中，我們評估了Siglec-6作為AML中CAR-T細(xì)胞的新靶抗原。Siglec-6已被鑒定為人單克隆抗體（mAb）JML-1的獨(dú)特靶抗原，其已從B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病（B-CLL）患者的異基因造血干細(xì)胞移植后（allo-HSCT）抗體庫中分離。Siglec-6由3個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白（Ig）結(jié)構(gòu)域和2個(gè)細(xì)胞內(nèi)免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）組成，與Siglec-3（CD33）的分子結(jié)構(gòu)非常相似。由于ITIM，Siglec-6被認(rèn)為是免疫細(xì)胞中激活途徑的調(diào)節(jié)因子，類似于其他與CD33相關(guān)的Siglec。在正常細(xì)胞和組織中，據(jù)報(bào)道，Siglec-6在B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、和胎盤中表達(dá)。然而，與其他Siglec家族成員不同，Siglec-6被認(rèn)為在T細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中不存在。在惡性細(xì)胞和組織中，據(jù)報(bào)道，Siglec-6在CLL、黏液相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、克隆性肥大細(xì)胞疾病、和甲狀腺癌中表達(dá)，以及正常發(fā)育和成熟的造血細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示Siglec-6在AML中普遍表達(dá)，而在正常HSPCs中不存在。我們還表明，在體外和體內(nèi)的臨床前模型中，被基因工程化以表達(dá)由JML-1 mAb的可變輕鏈（VL）和可變重鏈（VH）組成的Siglec-6 CAR的T細(xì)胞賦予了針對AML和CLL的特異性和有效的抗白血病功能。

材料和方法

流式細(xì)胞術(shù)分析Siglec-6的表達(dá)

使用別藻藍(lán)蛋白綴合的小鼠抗人Siglec-6mAb（克隆767329，R&D Systems，Minneapolis，MN）（原發(fā)性AML）或REAfinity抗人Siglec-6（克隆REA852，Miltenyi Biotec，Bergisch-Gradbach，Germany）（所有其他細(xì)胞類型）和相應(yīng)的同種型對照（小鼠IgG1或REA對照抗體[S]，人IgG1）分析Siglec-6（CD327）的表達(dá)。簡言之，將1×106個(gè)細(xì)胞洗滌，重懸于100μL磷酸鹽緩沖鹽水和0.5%胎牛血清中，并用抗Siglec-6mAb或同種型對照在4°C下染色30分鐘。在用克隆767329染色之前，用人IgG（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）在4°C下進(jìn)行Fc阻斷20分鐘。7-氨基-維甲酸霉素D（7-AAD）用于區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

U937異種移植物模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會（維爾茨堡大學(xué)）批準(zhǔn)了所有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。從Charles River（Sulzfeld，Germany）購買NOD.Cg-PrkdcsidIl2rgtm1WJ/SzJ（NSG）小鼠（雌性，6-8周齡），并用2×106螢火蟲螢光素酶（FLUC）-綠色熒光蛋白（GFP+）U937細(xì)胞或1×106 MOLM-13細(xì)胞接種。小鼠被隨機(jī)分配到治療組，并在指定的時(shí)間點(diǎn)接受5×106 T細(xì)胞（即在200μL磷酸鹽緩沖鹽水和0.5%胎牛血清中的2.5×106 CD4+和2.5×106 CD8+）。使用IVIS Lumina成像系統(tǒng)（PerkinElmer，Waltham，MA）在腹膜內(nèi)施用D-熒光素底物（0.3mg/g體重）（Biosynth，Staad，Switzerland）后，每周進(jìn)行一次生物發(fā)光成像（BLI）。通過使用Living Image軟件（PerkinElmer）分析生物發(fā)光圖像。

結(jié)果

Siglec-6 CAR-T細(xì)胞識別并消除AML細(xì)胞系

我們產(chǎn)生了一個(gè)單鏈可變片段（scFv），該片段包含抗Siglec-6mAb JML-1的VH和VL鏈，并衍生出2個(gè)具有CD28和4-1BB共刺激的類似Siglec-6 CAR。在制造結(jié)束時(shí)表達(dá)Siglec-6 CAR的T細(xì)胞的生長動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)量與未轉(zhuǎn)染（UTD）的T細(xì)胞相似。我們評估了Siglec-6在一組AML細(xì)胞系中的表達(dá)，并通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)了不同程度的Siglec-6表達(dá)（歸一化平均熒光強(qiáng)度[NMFI]范圍，8.22-0.76）：在U937和TF-1 AML細(xì)胞上為高，在MV4上為中/低；和MOLM-13 AML細(xì)胞，并且在K562和Kasumi-1細(xì)胞上非常低/檢測不到。通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）和超分辨率顯微鏡證實(shí)了這些AML細(xì)胞系之間Siglec-6表達(dá)的層次結(jié)構(gòu)。為了提供匹配的陽性對照細(xì)胞系，我們改造K562細(xì)胞以穩(wěn)定表達(dá)Siglec-6。

Siglec-6由AML細(xì)胞系表達(dá)，Siglec-6 CAR-T細(xì)胞在體外識別并消除AML細(xì)胞

接下來，我們試圖確定Siglec-6 CAR-T細(xì)胞對AML靶細(xì)胞的特異性。我們證實(shí)CD8+Siglec-6 CAR-T細(xì)胞具有針對U937、MV4的特異性細(xì)胞溶解活性；和MOLM-13 AML細(xì)胞系和K562/Siglec-6細(xì)胞，具有從高到低效應(yīng)物-靶點(diǎn)（E:T）比率的劑量-反應(yīng)關(guān)系（范圍，10:1到1:4）。我們使用UTD T細(xì)胞作為參考，CD19 CAR-T細(xì)胞作為特異性靶細(xì)胞裂解的對照。在用U937、MV4刺激后，我們觀察到CD8+和CD4+Siglec-6 CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)性細(xì)胞因子分泌和增殖；和MOLM-13 AML細(xì)胞系以及K562/Siglec-6細(xì)胞。我們未觀察到Siglec-6 CAR T細(xì)胞對K562和Kasumi-1細(xì)胞的特異性反應(yīng)性，這與qPCR和dSTORM未觀察到的Siglec-6表達(dá)一致。為了增加Siglec-6在AML細(xì)胞系表面的表達(dá)和Siglec-6 CAR的特異性的額外置信度，我們產(chǎn)生了等基因U937，MV4；和MOLM-13 Siglec-6敲除細(xì)胞系，并證實(shí)Siglec-6 CAR-T細(xì)胞的識別被消除）。線性回歸分析顯示，在4小時(shí)測定期內(nèi)，細(xì)胞溶解的速度和程度與AML細(xì)胞系上Siglec-6的表達(dá)相關(guān)（R2=0.91；P=.0009）。總體而言，表達(dá)具有CD28與4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的Siglec-6 CAR構(gòu)建體的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性同樣有效?？傊?，數(shù)據(jù)顯示Siglec-6是AML細(xì)胞系上的普遍靶標(biāo)，并通過表達(dá)Siglec-6 CAR的T細(xì)胞賦予特異性識別。

Siglec-6在原代AML母細(xì)胞上表達(dá)，包括AML干細(xì)胞

我們評估了Siglec-6在來自連續(xù)20名AML成年患者的原發(fā)性AML母細(xì)胞上的表達(dá)。該系列包括原發(fā)性和繼發(fā)性AML患者，以及具有不同分子和遺傳亞型的新診斷和既往治療（復(fù)發(fā)/難治性）AML患者。為了評估Siglec-6 CAR-T細(xì)胞在該隊(duì)列中的潛在適用性，我們使用流式細(xì)胞術(shù)分析（讀數(shù)：Siglec-6%表達(dá)閾值的NMFI，≥1.1）和Siglec-6 CAR-T細(xì)胞的識別（讀數(shù)：AML母細(xì)胞的細(xì)胞裂解閾值，≥30%）進(jìn)行了雙標(biāo)準(zhǔn)評估。通過使用流式細(xì)胞術(shù)，我們檢測到AML母細(xì)胞上不同程度的Siglec-6表達(dá)，并根據(jù)NMFI對患者進(jìn)行排名（范圍，5.79-0.89）。在細(xì)胞裂解分析中，我們檢測到Siglec-6+AML母細(xì)胞的快速有效消除。令人感興趣的是，我們還觀察到NMFI在低于表達(dá)閾值的AML樣品中的細(xì)胞溶解。這些數(shù)據(jù)表明，在我們的標(biāo)準(zhǔn)方案中，用直接偶聯(lián)的mAb通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的檢測不夠靈敏，不足以檢測可能足以觸發(fā)Siglec-6 CAR的非常低水平的Siglec-6表達(dá)。事實(shí)上，使用生物素化的抗Siglec-6 mAb并用鏈霉親和素藻紅蛋白擴(kuò)增，能夠更好地檢測低水平Siglec-6表達(dá)。在20名患者中，每名患者至少滿足2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的1項(xiàng)；在15名患者中，兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)均得到滿足。與AML細(xì)胞系的觀察結(jié)果類似，線性回歸分析顯示Siglec-6表達(dá)與Siglec-6 CAR-T細(xì)胞對AML母細(xì)胞的細(xì)胞溶解之間存在相關(guān)性（R2=0.45；P=0.0018）。我們還考慮了AML干細(xì)胞的亞群，據(jù)說該亞群具有增強(qiáng)的致白血病潛力和對治療的耐藥性，并且包含在AML母細(xì)胞的CD45dimCD34+CD38部分中。通過使用流式細(xì)胞術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)AML干細(xì)胞表達(dá)的Siglec-6水平類似于甚至高于大量AML母細(xì)胞的水平，并且對Siglec-6 CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞裂解同樣敏感。

Siglec-6通常在原代AML母細(xì)胞上表達(dá)，并被Siglec-6 CAR-T細(xì)胞識別

為了證實(shí)我們的數(shù)據(jù)，我們從3名AML患者中產(chǎn)生了Siglec-6 CAR-T細(xì)胞。Siglec-6 CAR-T細(xì)胞可以很容易地產(chǎn)生，其產(chǎn)量和純度與我們在來自健康供體的細(xì)胞中觀察到的相似。在每個(gè)患者中，Siglec-6 CAR-T細(xì)胞在用自體AML母細(xì)胞和AML細(xì)胞系刺激后，通過高水平的細(xì)胞溶解、細(xì)胞因子分泌和增殖，賦予了強(qiáng)大的抗白血病反應(yīng)性?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Siglec-6是AML中CAR-T細(xì)胞的相關(guān)靶點(diǎn)，并證明Siglec-6CAR T細(xì)胞在體外識別和消除原代AML母細(xì)胞。

Siglec-6 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)AML異種移植模型中有效

我們用FLUC+GFP+U937 AML細(xì)胞接種NSG小鼠，并通過流式細(xì)胞術(shù)評估外周血中循環(huán)AML細(xì)胞，并通過BLI評估髓外和髓外AML表現(xiàn)，在6天內(nèi)觀察到系統(tǒng)性白血病的快速發(fā)展。在第6天，我們用Siglec-6_28z或Siglec-6Bz-CAR T細(xì)胞或UTD T細(xì)胞處理小鼠。到第14天，我們觀察到白血病細(xì)胞從外周血中清除，BLI降低了系統(tǒng)性白血病負(fù)擔(dān)。Siglec-6 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)物（即CD28與4-1BB共刺激）均誘導(dǎo)了100%的應(yīng)答率（8只小鼠中的8只）。在第10天和第14天，在外周血中可檢測到Siglec-6CAR T細(xì)胞，并且Siglec-6Bz與Siglec-6_28z CAR T細(xì)胞相比具有更好的植入和體內(nèi)擴(kuò)增（在第14天：0.99%vs 0.25%，P?=0?.0002）。第21天，外周血AML持續(xù)緩解；然而，在所有小鼠中，我們觀察到向髓和髓外病變投射的殘余（甚至增加）BLI信號，在接受Siglec-6_28z-CAR-T細(xì)胞的小鼠中尤其明顯。因此，我們在第21天向所有治療組施用第二劑Siglec-6 CAR-T細(xì)胞，并且能夠通過BLI信號進(jìn)一步降低白血病負(fù)擔(dān)。到第35天，所有接受Siglec-6 CAR-T細(xì)胞的小鼠的BLI信號都與基線時(shí)（即白血病植入前）相同。通過進(jìn)一步的隨訪，我們觀察到8只接受Siglec-6Bz-CAR-T細(xì)胞的小鼠中有8只（100%）和8只接受了Siglec-6_28z-CAR-T細(xì)胞的小鼠的6只（75%）持續(xù)完全緩解。在Siglec-6_28z-CAR組的8只小鼠中的其余2只（25%）中，我們在第56天觀察到BLI信號增加，投射到髓外基因座。在第56天觀察期結(jié)束時(shí)，所有用Siglec-6 CAR T細(xì)胞處理的小鼠都是活的，并且在外周血、骨髓或脾臟中沒有檢測到AML細(xì)胞。所有用UTD T細(xì)胞處理的小鼠都顯示出有害的白血病進(jìn)展，并且必須在第21天之前實(shí)施安樂死。我們在接種了MOLM-13細(xì)胞（Siglec-6低表達(dá)）的NSG小鼠中進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)。Siglec-6 CAR-T細(xì)胞的治療具有抗白血病作用，并帶來顯著的生存益處，但與NSG/U937模型（Siglec-6高表達(dá)）相比，其效果明顯較差。

Siglec-6 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)AML異種移植模型中賦予強(qiáng)大的抗白血病活性

我們感興趣的是闡明Siglec-6Bz與Siglec-6_28z CAR T細(xì)胞相比具有優(yōu)異的體內(nèi)性能背后的潛在機(jī)制。在先前的報(bào)道中，4-1BB共刺激已顯示在CAR-T細(xì)胞中誘導(dǎo)有利于體內(nèi)持久性的獨(dú)特代謝程序。因此，我們進(jìn)行的代謝分析顯示，與Siglec-6_28z CAR T細(xì)胞相比，Siglec-6Bz的基礎(chǔ)耗氧量增加（表明氧化磷酸化），細(xì)胞外酸化率增加（表明有氧糖酵解），表明其具有優(yōu)越的生物能量能力?？傊?，數(shù)據(jù)表明Siglec-6 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)具有強(qiáng)大的抗白血病作用，并且能夠誘導(dǎo)侵襲性全身AML的長期緩解。數(shù)據(jù)還表明，Siglec-6Bz而不是Siglec-6_28z CAR-T細(xì)胞是臨床的首選產(chǎn)品。

Siglec-6在正常HSPCs中不表達(dá)

我們試圖評估Siglec-6 CAR-T細(xì)胞的靶向/腫瘤外反應(yīng)性潛力，并專注于發(fā)育和成熟的正常造血細(xì)胞。首先，我們從5名健康捐獻(xiàn)者的外周血中獲得了粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員的CD34+CD38-造血干細(xì)胞和CD34+CD38+造血祖細(xì)胞。我們進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析，并在所有5名健康供體的正常HSPCs上檢測到CD123、CD33、CLL-1和FLT3，與之前的報(bào)告一致。令人鼓舞的是，Siglec-6是唯一在所有5例供體的HSPCs上未檢測到的抗原。我們通過dSTORM超分辨率顯微鏡和qPCR在信使RNA轉(zhuǎn)錄水平上證實(shí)了HSPCs表面不存在Siglec-6。為了進(jìn)一步評估HSPCs靶向識別的潛力，我們應(yīng)用了流式細(xì)胞術(shù)分析和Siglec-6 CAR-T細(xì)胞識別的標(biāo)準(zhǔn)，我們也在評估原發(fā)性AML母細(xì)胞時(shí)應(yīng)用了該標(biāo)準(zhǔn)。我們沒有通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到Siglec-6（NMFI<1），并且在共培養(yǎng)試驗(yàn)中Siglec-6 CAR-T細(xì)胞對HSPCs沒有反應(yīng)性，即使在24小時(shí)內(nèi)的高E:T比率下也是如此。我們使用CD123 CAR-T細(xì)胞作為陽性對照，不出所料，發(fā)現(xiàn)HSPCs快速缺失。我們對CAR-T細(xì)胞和HSPCs進(jìn)行了24小時(shí)共培養(yǎng)，以評估它們啟動(dòng)譜系發(fā)育的能力，并在用Siglec-6 CAR-T細(xì)胞和UTD-T細(xì)胞處理后發(fā)現(xiàn)了類似的集落形成模式。

Siglec-6 CAR-T細(xì)胞不能識別正常的HSPCs

其次，我們分析了健康捐獻(xiàn)者（n≥7）外周血中成熟的正常造血細(xì)胞，并在一部分正常B細(xì)胞上檢測到Siglec-6的高表達(dá)，在一部分髓細(xì)胞上檢測出弱表達(dá)，在T細(xì)胞、NK細(xì)胞或NK T細(xì)胞上沒有表達(dá)。在正常B細(xì)胞群體中，Siglec-6在記憶B細(xì)胞上可檢測到高水平，在幼稚和未成熟B細(xì)胞上檢測到極低水平。髓系細(xì)胞的詳細(xì)亞群分析顯示，嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)Siglec-6，而中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為Siglec-6陰性。我們在體外從單核細(xì)胞中產(chǎn)生的髓源性樹突狀細(xì)胞也是Siglec-6陰性的。根據(jù)表達(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)與Siglec-6 CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)的B細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞部分缺失，而中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞沒有受到影響。我們使用胎盤（作為參考）和脾臟（作為對照）分析了Siglec-6在成人必需組織中的表達(dá)，胎盤已知表達(dá)Siglec-6，脾臟預(yù)計(jì)由于B細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的浸潤而產(chǎn)生信號。腦、乳腺或肝組織中沒有信號，回腸、結(jié)腸、肺、腎、心臟、卵巢和前列腺組織中偶爾出現(xiàn)的細(xì)胞信號非常低，與浸潤性免疫細(xì)胞一致?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Siglec-6在正常HSPCs上不表達(dá)，并且靶向Siglec-6不會干擾體外造血譜系發(fā)育。Siglec-6在記憶B細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上表達(dá)，這表明患者的靶向/非靶向腫瘤反應(yīng)性可能有限。

此外，作者還發(fā)現(xiàn)Siglec-6 CAR-T細(xì)胞對CLL中的惡性B細(xì)胞有效。

文章最后總結(jié)

總之，我們提出Siglec-6作為AML中CAR-T細(xì)胞的新靶點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)表明，Siglec-6 CAR-T細(xì)胞治療白血病細(xì)胞上高表達(dá)Siglec-6的患者是有效的，并且毒性可以接受。