為了尋找與COVID-19發(fā)病機(jī)制相關(guān)的潛在血清生物標(biāo)志物，研究者對12例COVID-19患者和4名健康對照者的血清細(xì)胞外囊泡進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究；此外，還對10例COVID-19患者和5例健康對照患者的外周血進(jìn)行了單細(xì)胞測序。單細(xì)胞測序結(jié)果顯示，MACROH2A1的表達(dá)定位于單個核細(xì)胞；對肺組織的單核RNA測序顯示，MACROH2A1在單個核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。此外，網(wǎng)絡(luò)分析表明，多個通路包括：雌激素信號通路、p160類固醇受體共激活因子（SRC）信號通路和轉(zhuǎn)錄調(diào)控STAT等表達(dá)在外周血核肺單核細(xì)胞單核細(xì)胞中?？傊狙芯拷Y(jié)果表明，細(xì)胞外囊泡中的MACROH2A1是COVID-19的潛在生物標(biāo)志物，可能是COVID-19的發(fā)病機(jī)制之一。
文章詳情
文章題目：Next-generation proteomics of serum extracellular vesicles combined with single-cell RNA sequencing identifes MACROH2A1 associated with refractory COVID-19
中文題目：蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合單細(xì)胞RNA測序揭示血清細(xì)胞外囊泡中MACROH2A1-1與COVID-19的相關(guān)性
發(fā)表時間：2022.09
期刊名稱：Inflammation and Regeneration
影響因子：10.426
實驗技術(shù)：10x Chromium 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、DIA-MS、免疫組化、Western blotting
DOI：10.1186/s41232-022-00243-5.
研究內(nèi)容
1、按COVID-19嚴(yán)重程度分析比較血清EVs蛋白質(zhì)組學(xué)及鑒定MACROH2A1
本研究對12例COVID-19患者和4例健康對照者進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，12例COVID-19患者分為三組：4例非危重（group 1）、4例危重和非難治（group 2）、4例危重和難治（group 3）。DIA非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)共檢測到3046個蛋白，其中2376個為識別肽片段的蛋白。對危重病例（group 2和3）的比較發(fā)現(xiàn)了12個差異蛋白；此外，Ingenuity Pathway Analysis（IPA）發(fā)現(xiàn)了29個差異蛋白，并且主要富集在Th1-pathway。接下來進(jìn)一步鑒別生物標(biāo)志物，從而將難治性病例與危重癥病例區(qū)分開來。根據(jù)疾病嚴(yán)重程度比較關(guān)鍵和非關(guān)鍵的蛋白質(zhì)組（group 2、3 vs 1），結(jié)果鑒定出174個具有顯著差異的蛋白。根據(jù)年齡和性別調(diào)整的線性回歸分析中，發(fā)現(xiàn)了一種蛋白MACROH2A1按疾病嚴(yán)重程度顯著增加，研究者推測該蛋白是預(yù)測難治性COVID-19最可能的生物標(biāo)志物。
2、MACROH-19重癥患者血清EVs和肺組織中MACROH2A1的表達(dá)增強(qiáng)
蛋白質(zhì)組學(xué)中MACROH2A1的表達(dá)在group 3中明顯高于其他組，與血清EVs的WB結(jié)果相一致。對致死性COVID-19患者肺組織切片的免疫組化分析顯示，肺泡巨噬細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞核中MACROH2A表達(dá)增加。因此，研究者確定MACROH2A是與難治性COVID-19發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。
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3、scRNA-seq發(fā)現(xiàn)MACROH2A1在COVID-19危重患者的單個核細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)
接下來，為了研究MACROH2A1在COVID-19危重患者中的作用，對3名非危重性和7名危重性（4名非難治性和3名難治性）患者的單個核細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，檢測MACROH2A1在免疫細(xì)胞的表達(dá)情況。共獲得了91,830個細(xì)胞，注釋了9個細(xì)胞亞群。其中，MACROH2A1在單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)水平特異性增強(qiáng)，此外，MACROH2A1的表達(dá)在危重病例中顯著上調(diào)，而非危重病例僅在單核細(xì)胞中顯著上調(diào)，提示MACROH2A1可能通過單核細(xì)胞參與嚴(yán)重SARS-CoV-2感染的發(fā)病機(jī)制。
4、fatal COVID-19患者肺單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中MACROH2A1的表達(dá)增強(qiáng)?
接下來，對19例COVID-19患者和7例對照患者肺組織樣本進(jìn)行單核RNA測序（snRNA-seq），以進(jìn)一步研究MACROH2A1在COVID-19中的作用。結(jié)果共獲得19種細(xì)胞類型，與PBMC scRNA-seq的檢測結(jié)果一致，在COVID-19尸檢標(biāo)本中，MACROH2A1在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量高于對照組。綜上所述，MACROH2A1在循環(huán)免疫細(xì)胞和COVID-19患者肺組織中表達(dá)上調(diào)，提示MACROH2A1可能通過單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能參與了COVID-19肺炎的發(fā)病機(jī)制。
5、MACROH2A1對Toll樣受體7配體和IFN-gamma的反應(yīng)性增加
基于上述研究結(jié)果，為了進(jìn)一步研究刺激先天免疫系統(tǒng)以應(yīng)對病毒感染，是否誘導(dǎo)了MACROH2A1，研究者通過PMA刺激人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化，添加toll樣受體（TLR）配體和干擾素（IFN-gamma）進(jìn)行刺激。結(jié)果顯示，IFN-gamma顯示出更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。說明，COVID-19感染后，MACROH2A1可能是通過TLR信號通路或IFN-gamma刺激在肺部或循環(huán)血液中被誘導(dǎo)，以應(yīng)對病毒感染。
6、MACROH2A1對Toll樣受體7配體和IFN-gamma的反應(yīng)性增加
最后，為了整合這些血清EVs蛋白質(zhì)組學(xué)、PBMC scRNA-seq，snRNA-seq數(shù)據(jù)的總體趨勢，使用KeyMolnet進(jìn)行分子網(wǎng)絡(luò)分析。在MACROH2A1上游分子網(wǎng)絡(luò)中，group 2和3中的EVs蛋白更多的富集到雌激素信號通路；group2、3與group 1相比，PBMC scRNA-seq單個核細(xì)胞主要富集到雌激素信號通路。此外，在MACROH2A1下游的分子網(wǎng)絡(luò)種，血清EVs蛋白質(zhì)組學(xué)中檢測的蛋白，富集到“p160類固醇受體共激活因子（SRC）信號通路”和“STAT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控”。這些結(jié)果顯示了一個與所有三種組學(xué)分析相同的通路，表明在血清EVs蛋白質(zhì)組學(xué)中，MACROH2A1在單核細(xì)胞中的功能得到了一定程度的重復(fù)。
主要結(jié)論
本研究首次證明，EVs中的MACROH2A1是難治性COVID-19感染的潛在候選生物標(biāo)志物，并且MACROH2A1可能通過單核細(xì)胞系和對SARS-CoV-2的先天免疫應(yīng)答，介導(dǎo)了嚴(yán)重COVID-19的發(fā)病。此外，還可以考慮靶向MACROH2A1的藥物開發(fā)。
參考文獻(xiàn)
Kawasaki, Takahiro et al.“Next-generation proteomics of serum extracellular vesicles combined with single-cell RNA sequencing identifies MACROH2A1 associated with refractory COVID-19.” Inflammation and regeneration vol. 42,1 53. 30 Nov. 2022, doi:10.1186/s41232-022-00243-5
