##Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation

摘要：

背景：全基因組轉(zhuǎn)錄組分析極大地促進(jìn)了對(duì)基礎(chǔ)心臟生物學(xué)和疾病驅(qū)動(dòng)機(jī)制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解。然而，到目前為止，研究成人心臟基因表達(dá)模式的分辨率僅限于整個(gè)組織提取物的水平。組織勻漿的使用固有地導(dǎo)致基因表達(dá)中細(xì)胞起源或細(xì)胞類型特異性變化的任何信息的丟失。RNA擴(kuò)增策略的最新發(fā)展為使用少量輸入RNA進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測(cè)序提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。

方法：提出一種從成年小鼠消化的心臟組織中獲得高質(zhì)量RNA的方法，用于健康和患病心臟的自動(dòng)單細(xì)胞測(cè)序。

結(jié)果：優(yōu)化后，能夠在穩(wěn)態(tài)條件下和缺血損傷后對(duì)成年心臟組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。基于差異基因表達(dá)的聚類分析揭示了所有主要心臟細(xì)胞類型的已知和新標(biāo)記?；诨虮磉_(dá)的差異，可以在某一細(xì)胞類型中識(shí)別多個(gè)亞群。此外，對(duì)健康和受傷的心臟應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序表明存在疾病特異性細(xì)胞亞群。因此，鑒定了細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白4（CKAP4）作為活化成纖維細(xì)胞的新標(biāo)記物，其與小鼠和人類心臟組織中已知的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物呈正相關(guān)。與對(duì)照組相比，用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β處理的活化成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白4的抑制引發(fā)了與活化成纖維相關(guān)基因表達(dá)的更大增加，這表明細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)4在調(diào)節(jié)受損心臟中成纖維細(xì)胞活化中的作用。

結(jié)論：對(duì)健康和患病成人心臟進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，可以研究心臟細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄組差異，以及心臟病期間基因表達(dá)的細(xì)胞類型特異性變化。這一新方法為與心臟生物學(xué)和病理生理學(xué)相關(guān)的細(xì)胞過程中的分子變化提供了豐富的新見解。應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)與心臟病相關(guān)的新治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6J小鼠，缺血再灌注（IR）手術(shù)。術(shù)后3天收集并分析心臟。

取樣區(qū)域：梗死區(qū)（梗死區(qū)和邊緣區(qū)）或?qū)φ招呐K的相應(yīng)區(qū)域

FIG 1

結(jié)果：

1.Isolation of High-Quality RNA From Digested Hearts From Adult Mice

為了創(chuàng)建所有心臟細(xì)胞類型的可靠基因表達(dá)圖譜，首先確定組織消化和RNA提取的最佳方法，以從心臟的單細(xì)胞懸浮液中獲得高質(zhì)量RNA。處死小鼠，然后用冷灌注緩沖液灌注心臟。收集左心室前壁后，將組織在冰冷的灌注緩沖液中清洗，保存在冰上，切碎成小塊，并轉(zhuǎn)移到裝有冷消化緩沖液的玻璃瓶中。消化組織后，將細(xì)胞懸浮液輕輕地上下吸移，然后將裂解物通過100μm的細(xì)胞過濾器。然后用DMEM沖洗過濾器，收集細(xì)胞用于隨后的RNA提取或流式細(xì)胞術(shù)（圖1A和1B）?；诩?xì)胞形態(tài)和RNA質(zhì)量，在Trizol RNA分離之前，使用游離酶在37°C搖動(dòng)水浴中消化成年心臟組織15分鐘，是獲得心臟單細(xì)胞懸浮液的最佳方法。

2.Single-Cell Sorting Strategy

酶法分散心臟組織后，用流動(dòng)比色法分離細(xì)胞。使用大噴嘴尺寸（130μm）可以分選所有范圍的心臟細(xì)胞，而不會(huì)損傷更大的心肌細(xì)胞。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明心肌細(xì)胞大多完好。

3.Single-Cell Sequencing to Identify Gene Expression Signatures in All Main Cardiac Cell Types

使用SORT-Seq協(xié)議，平均每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到5個(gè)原始唯一讀取。在質(zhì)控后，來自3個(gè)不同對(duì)照心臟的426個(gè)細(xì)胞用于下游的分析。使用RaceID2算法識(shí)別和分析所有主要的心臟細(xì)胞類型，1-Pearson相關(guān)系數(shù)的K-medoids聚類顯示成年心臟中有14個(gè)不同的細(xì)胞簇（圖2A）。t-SNE圖表明存在心肌細(xì)胞（圖2D）、成纖維細(xì)胞（圖2E）、內(nèi)皮細(xì)胞（圖2AF）和巨噬細(xì)胞（圖2G）。

FIG 2

3.Contribution of Mitochondrial Transcripts Differ for Individual Cell Types

在研究所有主要心臟細(xì)胞類型中的基因表達(dá)特征時(shí)，觀察到線粒體和基因組轉(zhuǎn)錄物的貢獻(xiàn)在不同細(xì)胞中不同。與其他心肌細(xì)胞類型相比，所有心肌細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)錄物百分比更高（占總轉(zhuǎn)錄物的58%至86%）。由于線粒體轉(zhuǎn)錄物非常豐富，將其排除在聚類分析之外，只關(guān)注基因組基因的差異表達(dá)。

4.Single-Cell Sequencing Identifies Cell Type-Specific Subpopulations in the Healthy Heart

根據(jù)標(biāo)記基因的基因表達(dá)，識(shí)別了4個(gè)不同的心肌細(xì)胞簇、2個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞簇、2個(gè)成纖維細(xì)胞簇、2個(gè)巨噬細(xì)胞簇、1個(gè)平滑肌細(xì)胞簇和1個(gè)紅細(xì)胞簇。在心肌細(xì)胞4中，該簇表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記物，如心肌肌鈣蛋白t、Tnnt2（圖4A）。然而，它是唯一富含Myozen2（Myoz2）表達(dá)的心肌細(xì)胞亞群（圖3和4B）。在小鼠中也同樣檢測(cè)到了富含Myoz2的心肌細(xì)胞簇，且富含Myoz2的心肌細(xì)胞簇確實(shí)不同于其他心肌細(xì)胞簇。

FIG 3

免疫組織化學(xué)顯示，MYOZ2在位于心臟心外膜表面的一層心肌細(xì)胞（與TNNT2共染色）中富集（圖4C）。與其他心肌細(xì)胞相比，富含Myoz2的簇中最受差異調(diào)節(jié)的基因的基因本體分析表明，高檢測(cè)基因與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病有關(guān)（圖4D），而低表達(dá)基因似乎與心臟疾病相關(guān)（圖4E）。Myoz2，也稱為Calsarcin-1，是病理性促肥大磷酸酶鈣調(diào)素的抑制劑。

FIG 4

5.Single-Cell Sequencing of the Injured Heart

將小鼠暴露于缺血損傷（IR）中，并在IR后3天收集樣品。從心臟梗死區(qū)域分離了509個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞。將這些細(xì)胞與先前從對(duì)照心臟相應(yīng)區(qū)域獲得的426個(gè)細(xì)胞合并，用于RaceID2的計(jì)算機(jī)分析。1-Pearson相關(guān)性的K-medoids聚類顯示對(duì)照組和IR心臟后3天的所有匯集細(xì)胞中有17個(gè)不同的細(xì)胞簇。

6.Inter- and Intracellular Gene Expression Changes Induced by Ischemic Injury

損傷引發(fā)了疾病富集細(xì)胞簇的出現(xiàn)，識(shí)別到3個(gè)不同的成纖維細(xì)胞簇（7、13和15）（圖5B至5D）。簇13和簇15中的細(xì)胞主要來源于受傷的心臟，而簇7包含來自兩種情況的細(xì)胞（圖5C和5D）。來自簇13和簇15的細(xì)胞的特征是Postn、Wisp1和Tnc的相對(duì)高表達(dá)，先前與成纖維細(xì)胞活化相關(guān)，t-SNE圖譜再次證實(shí)了這些基因在疾病富集的成纖維細(xì)胞簇中的富集表達(dá)。通過對(duì)對(duì)照或受傷心臟的心臟組織進(jìn)行qPCR驗(yàn)證了這些基因的疾病特異性誘導(dǎo)（圖5F）

FIG 5

7.Ckap4 Expression Is Specifically Increased in Activated Fibroblasts

在確定了來自健康和患病心臟的成纖維細(xì)胞群體（簇7）和主要來自患病心臟的群體（簇13和簇15）后，接下來確定了這些群體之間的差異表達(dá)基因。疾病富集的成纖維細(xì)胞群體中有11個(gè)基因上調(diào)，20個(gè)基因下調(diào)（圖5G）。發(fā)現(xiàn)205個(gè)基因在健康和來自簇1、3、4和8的缺血心肌細(xì)胞，而來自健康或缺血心臟的巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)191個(gè)基因，形成簇5、9、14和16。這些疾病富集簇中的上調(diào)基因與細(xì)胞外基質(zhì)沉積和膠原沉積相關(guān)的各種過程有關(guān)（圖5H），這是心臟缺血損傷后纖維化反應(yīng)的標(biāo)志。根據(jù)這一觀察，在富集的基因中，檢測(cè)到已知在活化的成纖維細(xì)胞中表達(dá)的各種膠原基因和標(biāo)記物，如Postn（圖5I）。對(duì)缺血性心臟中富含疾病相關(guān)基因的聚類的鑒定進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了我們聚類方法的有效性。

除了已知的活化成纖維細(xì)胞標(biāo)記物外，還發(fā)現(xiàn)Ckap4在這群活化成纖維纖維細(xì)胞中上調(diào)。Ckap4是一種跨膜蛋白，可以作為不同細(xì)胞中各種配體的受體。然而，其在心臟成纖維細(xì)胞中的功能仍然未知。通過bulk-RNA測(cè)序來確認(rèn)缺血損傷后整個(gè)心臟中Ckap4的上調(diào)（圖5J）。單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)檢測(cè)到Ckap4在活化的成纖維細(xì)胞中的特異性上調(diào)，而不是在任何其他細(xì)胞類型中的上調(diào)(t-SNE)（圖5K和5L）。通過免疫組織化學(xué)，驗(yàn)證缺血損傷后心臟中CKAP4的誘導(dǎo)，其與表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白的細(xì)胞重疊（圖6A）。為了研究活化成纖維細(xì)胞中Ckap4表達(dá)的功能相關(guān)性，抑制了成纖維細(xì)胞的Ckap2表達(dá)，然后將其暴露于TGFβ中（圖6B）。與對(duì)照組相比，TGFβ能夠誘導(dǎo)Ckap4表達(dá)。siRNA介導(dǎo)的Ckap4抑制導(dǎo)致了mRNA和蛋白質(zhì)水平上的Ckap4的劑量依賴性降低（圖6C）（圖6D）。qPCR分析表明，TGFβ治療導(dǎo)致活化成纖維細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的增加，并且在這種條件下抑制Ckap4進(jìn)一步增強(qiáng)了這種作用（圖6E）。盡管這一發(fā)現(xiàn)值得進(jìn)一步研究，但這似乎意味著活化成纖維細(xì)胞中的CKAP4能夠抑制與活化成纖維相關(guān)基因的表達(dá)。同樣，在來自缺血性心臟病患者的心臟樣品中，我們能夠確認(rèn)CKAP4和已知在激活的心臟成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)的基因之間的表達(dá)正相關(guān)（圖7A至7C）。此外，免疫組織化學(xué)顯示，人類缺血心臟中CKAP4表達(dá)與各種成熟的成纖維細(xì)胞標(biāo)記物之間存在強(qiáng)烈重疊（圖8D），這表明CKAP4在人類活化的成纖維纖維細(xì)胞中也有作用。

FIG 6

FIG 7

DISCUSSION

一部分心肌細(xì)胞表達(dá)Myoz2，一種屬于肌聚蛋白家族的蛋白。Myoz2已被證明能將α-肌動(dòng)蛋白與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（一種眾所周知的心肌細(xì)胞肥大誘導(dǎo)物）連接，從而抑制心肌細(xì)胞的病理性肥大反應(yīng)。Myoz2的表達(dá)僅限于心肌細(xì)胞的一個(gè)子集，提示主要位于心臟的心外膜區(qū)域的心肌細(xì)胞亞群對(duì)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)的肥大反應(yīng)不同，其中一些細(xì)胞比其他細(xì)胞更具抵抗力。

對(duì)健康和受傷心臟的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較表明，疾病會(huì)產(chǎn)生已知細(xì)胞類型的新亞群，這些亞群似乎對(duì)來自患病心臟的細(xì)胞具有特異性或富集性。盡管已知心臟的細(xì)胞組成在病理應(yīng)激期間發(fā)生變化，但在檢測(cè)心臟應(yīng)激期間每種細(xì)胞類型內(nèi)特異性表達(dá)的全基因組變化方面的能力有限。單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)現(xiàn)在允許識(shí)別不同條件下所有主要心臟細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組差異。通過定義與疾病相關(guān)的細(xì)胞亞群和基因表達(dá)的相關(guān)變化，確定與心臟病潛在細(xì)胞變化相關(guān)的新分子機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)Ckap4在與Postn、Ctrc1和Fn1相同的細(xì)胞群中表達(dá)，Postn是心臟肌成纖維細(xì)胞的已知標(biāo)志物。對(duì)照組和對(duì)照組的免疫組織化學(xué)缺血性心臟證實(shí)CKAP4的表達(dá)對(duì)應(yīng)激心臟是特異性的，并且與波形蛋白重疊，波形蛋白是缺血性心臟中成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物。體外Ckap4功能的喪失表明，在TGFβ刺激前后，肌成纖維細(xì)胞相關(guān)基因過度激活，這表明Ckap1在成纖維細(xì)胞激活過程中起作用。此外，在缺血性心臟病患者的心臟活檢中觀察到CKAP4和成纖維細(xì)胞標(biāo)記物之間的正相關(guān)。