宮頸癌是女性癌癥死亡的第四大原因，其中宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）是最常見的類型。不幸的是，晚期、轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性CSCC的5年生存率僅為16.5%。盡管免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)從根本上改變了臨床腫瘤的治療范式，但CSCC對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)有限，這與腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)的復(fù)雜性相關(guān)。細(xì)胞異質(zhì)性和可塑性是腫瘤進(jìn)展和腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)，但這些細(xì)胞狀態(tài)的形成和可塑性等調(diào)控機(jī)制仍有待確定。隨著單細(xì)胞及空間組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，聯(lián)合細(xì)胞微環(huán)境和空間位置來全面理解細(xì)胞功能已成為研究腫瘤免疫微環(huán)境的重要方式。

1. A single-cell expression atlas of CSCC

To comprehensively decode the CSCC ecosystem, 作者對(duì)14例未治療患者的樣本和3例對(duì)照樣本進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，得到哦163880個(gè)細(xì)胞，注釋得到14種主要細(xì)胞類型。

2. Meta-programs within the CSCC malignant compartment

研究顯示，惡性上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性形成了其與腫瘤免疫微環(huán)境特異性的互作，決定了腫瘤命運(yùn)。因此接下來作者探究了CSCC 鱗狀上皮細(xì)胞的 cellular state diversity。20168個(gè)腫瘤鱗狀細(xì)胞在患者間存在顯著的異質(zhì)性(c)。NMF顯示，存在8個(gè)模塊 (d)。
It is noteworthy that three MPs (MP6, MP7 和 MP8) representing various stages of squamous differentiation were identified, with signature genes primarily composed of epithelial markers such as the keratin, mucin and small proline-rich protein families.
MP6 (epithelial-cytokeratin) 與 HNSCC_epi2 signature 存在高度一致性，而與pan-cancer study 中的 epithelial senescence (Epi-Sen) 相似度較低。MP6主要富集到keratinization-related genes, 提示其鱗狀細(xì)胞癌特異性特征。
MP8 (Epi-Sen)則與 HNSCC_epi1 state 和 pan-cancer 中的Epi-Sen相似，代表著一種與HPV相關(guān)的 common senescence-associated epithelial status。
MP7 (Epi-Imm) featured multiple immune cell-associated molecules (HLA-DRB, B2M and IDO1), indicating its immune-related epithelial status.

3. MP6 and MP7 exhibit distinct correlations with TIME

To prioritize the most relevant MPs associated with the TIME, we correlated the summarized expression (eigengene) values of each MP with percentages of TIME cells inferred from scRNA-seq data within individual patients.
有趣的是，MP6 與cancer-associated fibroblast (CAF) 強(qiáng)正相關(guān)，而與免疫細(xì)胞負(fù)相關(guān) (CD4_Th-CXCL13, CD8_Tex-GZMK and CD4-MKI67)(e)。而MP7與免疫細(xì)胞正相關(guān)，與CAF負(fù)相關(guān)(附件)。These findings highlight the diametrically opposed association of MP6 and MP7 with immune cell infiltration.
接著，作者根據(jù)NMF的結(jié)果對(duì)MP進(jìn)行分群(f, g)，結(jié)果同樣顯示腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的異質(zhì)性。

4. MP6 and MP7 are associated with distinct TIP (tumor immune phenotype)

除了豐度以外，CD8⁺ T細(xì)胞的空間定位也對(duì)TIME stratification和免疫治療反應(yīng)性至關(guān)重要。為了評(píng)估MPs 和 TIPs 的關(guān)系，作者根據(jù)CD8⁺ T的分布情況對(duì)每個(gè)腫瘤進(jìn)行了TIP分型（a）：
(1) infiltrated TIP with CD8⁺ T cells penetrating the tumor epithelium（腫瘤組織中有CD8T）
(2) excluded TIP with CD8⁺ T cells primarily embedded in the surrounding stroma（腫瘤周圍基質(zhì)中有CD8T）
(3) desert TIP with CD8+ T cell absence.（無）

根據(jù)這個(gè)分型，作者將所有的樣本分為了infiltrated or
excluded/desert TIPs (b)。單細(xì)胞的結(jié)果顯示infiltrated TIP CD8T細(xì)胞數(shù)量顯著更多(c, d)。此外，基于RO/E的 density estimation 和 immune cell enrichment 結(jié)果提示存在顯著的 TIP-specific differences, 尤其是T cell states (e-g)。更重要的是，the excluded/desert CSCCs 存在更高比例的 MP6 細(xì)胞，而且infiltrated CSCC 存在更高比例的 MP7 細(xì)胞 (Fig. 2h,i), 提示腫瘤 MPs 和 TIPs之間存在潛在關(guān)聯(lián)。

5. Spatially resolved TIME neighboring MP6 and MP7

為了進(jìn)一步探究MP6, MP7和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的空間關(guān)系，作者整合了單細(xì)胞數(shù)據(jù)和15例CSCC空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)(a, b)。為了比較腫瘤MP6和MP7 states的空間異質(zhì)性，作者計(jì)算了每個(gè)腫瘤 spots 的 MP6 和 MP7 signature genes 評(píng)分，隨后使用了hierarchical clustering來區(qū)分每個(gè)spot到底是 MP6還是MP7(c)。結(jié)果顯示這兩個(gè)stat在空間上是互斥的。
為了探究TIME細(xì)胞組成和MP6以及MP7的關(guān)系，作者對(duì)每個(gè)spot進(jìn)行了解卷積(d, e)，以判斷MP6/MP7腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞存在情況。結(jié)果顯示在15個(gè)空間切片上，MP7 spots的 immune cell neighborhood scores顯著更高，尤其是CD4T, CD8T, B, 巨噬和DC (f)。此外，MP6, MP7 和 cell neighborhood scores的相關(guān)性分析 提示MP7和immune cell neighborhoods存在著顯著正相關(guān)，而 MP6 則與 immune cell neighborhoods 負(fù)相關(guān)(g)。隨后，作者檢測(cè)了可以區(qū)分MPs和TIPs的marker基因的表達(dá)。Tumors with high 高表達(dá) SERPINB3 和 FABP5 (MP6 dominant tumors) 的腫瘤 MUC4 的表達(dá)較低且缺乏 CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)。相反，高 MUC4 (MP7 dominant tumors) 表達(dá)的腫瘤 SERPINB3- 和 FABP5-陽性腫瘤細(xì)胞較少，但是有顯著 CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)。

Fig 3

6. MP7 is spatially distinct from the conventional ‘immune-hot’ signature

為了進(jìn)一步探究MP7和此前鑒定的 pan-cancer immune programs (Extended Data Fig. 2c) 的區(qū)別，作者在空間上查看了它們的表達(dá)模式。MP7 傾向于具有腫瘤上皮的代表性特征 (fig 3c)。而 pan-cancer immune signature 則傾向于分布在腫瘤邊緣 (Extended Data Fig. 6f )。這提示 pan-cancer immune signature 主要反映了周邊腫瘤細(xì)胞對(duì)來自其周圍免疫細(xì)胞的近分泌和旁分泌信號(hào)的反應(yīng)。
immune-hot signature常被用于預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)免疫治療的反應(yīng)性，通過將immune-hot signature引入空間數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn) immune-hot activity 主要存在于基質(zhì)區(qū) (Extended Data Fig. 6g,h), 這與其作為腫瘤免疫微環(huán)境的代表性作用相一致。相反，MP7 signature 主要存在于 epithelial tumor regions, 提示其代表一種腫瘤細(xì)胞特異的狀態(tài)。因此，MP7 在空間上與此前報(bào)道的 pan-cancer immune 和 immune-hot signatures存在差別。

7. Transforming growth factor β signaling is activated in MP6

MP6 status 的腫瘤細(xì)胞的存在其特異表達(dá)模式 (包括 FABP5, SPRR1B, SERPINB3, KRT6B 和 S100A8)，這些基因主要富集到 keratinization process，而 MP7 腫瘤細(xì)胞則高表達(dá)抗原呈遞相關(guān)基因 (包括 HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1 和 CD74), 免疫反應(yīng) (包括 B2M, LCN2 和 CXCL10), 免疫抑制分子 (包括 IDO1, CD274, CD276 和 BTN3A1) 和多種粘蛋白 (包括 MUC1, MUC16 和 MUC20)，這些基因主要富集到抗原呈遞和免疫反應(yīng)通路 (a)。MP6和MP7的差異基因比較也顯示了一致的結(jié)果 (b)。

為了進(jìn)一步確定RNA水平變化是否會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的改變，作者使用了激光捕獲顯微切割(LCM)技術(shù)從而在空間上在不同程度的TILs中定義腫瘤的ROI (regions of interest)。作者一共分離了60個(gè)空間特異的 ROIs (約 100 × 100 μm²，每個(gè)ROI中約有60–80個(gè)細(xì)胞) 包括20個(gè)immune-rich的和40個(gè)免疫 immune-poor 的ROIs(c)。MP6特異性基因，比如 FABP5, SERPINB3, KRT6B 和 S100A8，在 immune-poor ROIs 中高表達(dá)，這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相一致 (d)。此外，盡管25個(gè)MP7特異性基因只有3個(gè)在空間蛋白組中檢測(cè)到，B2M 和多種 MHC 分子在 immune-rich ROIs 中升高 (d)。
單細(xì)胞數(shù)據(jù)的PROGENy通路分析結(jié)果顯示TGFβ通路在MP6中顯著富集(e)，而空間轉(zhuǎn)錄組的PROGENy通路分析也顯示MP6比MP7有更高水平的TGFβ通路活化，空間蛋白組結(jié)果同樣顯示TGFβ 信號(hào)通路在 immune-poor ROIs 中顯著增強(qiáng)(f)。值得注意的是， PROGENy TGFβ 信號(hào)主要位于MP6腫瘤區(qū)域的邊緣(g)，這提示 TGFβ 通路可以改變癌周的免疫微環(huán)境，比如CAFs 和免疫細(xì)胞。

Fig 4

8. CAF enforced immune lockdown surrounding MP6 spots

最近的研究結(jié)果顯示不同的 CAF 表型與異質(zhì)性的TIPs有關(guān)。然而，CAF的空間定位及其亞型與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系尚不明確。在這里，作者鑒定了7種不同的成纖維亞群，其中3群 (CAF-CD34, CAF-DES 和 CAF-MMP11) 在 CSCC 樣本中比例顯著上升 (a, b)。根據(jù)每個(gè)亞群的特征性基因表達(dá)，我們可以知道，CAF-CD34 細(xì)胞高表達(dá)IL-1活化信號(hào)，屬于既往文獻(xiàn)報(bào)道中的inflammatory CAFs。而 CAF-MMP11 則高表達(dá) TGFβ 活化信號(hào)，屬于 myCAFs。PROGENy 分析證實(shí)了CAF-MMP11中存在TGFβ 信號(hào)通路的激活 (c)。CAF-MMP11 表達(dá) TGFβ-induced reactive stroma相關(guān)基因，包括 MMP11, POSTN, CTHRC1, COL8A1, COL10A1 (d)。通路分析結(jié)果同樣顯示其主要參與上皮基質(zhì)轉(zhuǎn)化和胞外基質(zhì)形成 (e)。此外，CAF-MMP11顯著高表達(dá)LRRC15，這個(gè)基因與抗腫瘤反應(yīng)的抑制效應(yīng)直接相關(guān) (f)。
TIME中MP6評(píng)分和免疫抑制性CAF比例的正相關(guān) (Supplementary Table 4) 及Fig 4g中MP6周圍活化的TGFβ信號(hào)使得作者進(jìn)一步探究了其原位空間互作和空間蛋白表達(dá)情況。因此作者計(jì)算了每個(gè)成纖維空間 spot 上 MMP11基因模塊 (包括 CTHRC1, POSTN, INHBA, SFRP2, SULF1, COL8A1, COL11A1 和 LRRC15) 的表達(dá)。結(jié)果顯示MP6 腫瘤細(xì)胞周圍的成纖維存在上調(diào)的免疫抑制CAF特征 (Fig. 5g, left)。同時(shí)，Cyto- SPACE 顯示MP6 腫瘤細(xì)胞周圍的成纖維，尤其是在腫瘤-基質(zhì)邊緣區(qū)，主要是 CAF-MMP11，而這種現(xiàn)象在MP7周圍的成纖維細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn) (Fig. 5g, right)。通過評(píng)估MP6和MP7特征在成纖維周圍的表達(dá)，作者觀測(cè)到MP6而不是MP7和免疫抑制性CAF評(píng)分存在顯著的正相關(guān) (h)。此外，細(xì)胞互作結(jié)果也顯示 MP6 周圍存在上調(diào)的TGFβ信號(hào) (Supplementary Figs. 4 and 5, Supplementary Note 5 and Supplementary Table 8)。

Fig 5

9. MP6/7 score is of clinical relevance

為了進(jìn)一步探究 tumor state 和免疫表型的特異性關(guān)聯(lián)，作者以單細(xì)胞數(shù)據(jù)作為參照，使用 BayesPrism25 對(duì)一項(xiàng)宮頸鱗癌的新輔助免疫化療（NACT）臨床試驗(yàn)（NCT04516616）中21例患者的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了解卷積，以探究每個(gè)樣本的MP6或MP7特征。與預(yù)期一致， 高 MP6/7 評(píng)分的腫瘤存在較低的免疫激活和免疫逃避，免疫細(xì)胞降低，immune excluded 相關(guān)細(xì)胞比如 mesenchymal stem cells, myocytes 和 keratinocytes則更高 (a)。對(duì)RNAseq隊(duì)列中的20例樣本的免疫組化結(jié)果顯示CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)與 MP6/7 score 負(fù)相關(guān) (b, c)。

接著，作者對(duì)21個(gè)患者的paired pre and post one-cycle neoadjuvant chemotherapy 樣本進(jìn)行了RNAseq測(cè)序。顯著的是，MP6/7 scores 在 one cycle of platinum-based NACT 后顯著下降，而且在 pathological complete remission (pCR) 組中下降最顯著 (Fig. 6d and Supplementary Table 11)。
隨后作者在squamous nonsmall cell lung cancer (NSCLC) 中探究了是否 MP6 和 MP7 腫瘤狀態(tài)可以提示其對(duì) ICB therapy 的反應(yīng)性。（為什么用肺癌？沒有宮頸癌的隊(duì)列數(shù)據(jù)嗎？）在兩個(gè)大型squamous NSCLC 亞型的ICB治療隊(duì)列中 (OAK 和 POPLAR; anti-PD-L1 antibody 或化療 (docetaxel))，低 MP6/7 scores 都與免疫治療組更好的預(yù)后相關(guān)，而在化療組則沒有這種相關(guān)性 (Fig. 6e,f)。而在 nonsquamous NSCLC中，低 MP6/7 scores 與免疫治療和化療組都沒有顯著相關(guān)性 (Extended Data Fig. 8d,e)，提示 MP6/7 scores 對(duì) CSCC 和 NSCLC 免疫治療反應(yīng)性的潛在預(yù)測(cè)作用。

Fig 6

10. FABP5 mediates MP6 state maintenance

MP6 和 MP7腫瘤 states 與CSCC 的表觀改變而不是基因異質(zhì)性更相關(guān) (Supplementary Fig. 7 and Supplementary Note 7)。作者隨后探究了 MP6 state的 defining features。除了角化基因的表達(dá)，其特征性基因還包括 SERPINB3 和 S100A8/A9，兩者都與 CSCC的 advanced stage 和 unfavorable prognosis 相關(guān)。有趣的事，top-scoring 差異性表達(dá)基因中有一個(gè)分子是 FABP5/FABP5 (Fig 4 a, b)。這個(gè)分子編碼脂肪酸結(jié)合蛋白，在此前被報(bào)道與多種癌癥相關(guān)。沉默 FABP5 在宮頸癌和HNSCC細(xì)胞系中引起顯著的 MP6 特征基因表達(dá)的下降(a, b)。FABP5-IN-1, 一種選擇性 FABP5 抑制劑，抑制了CSCC患者來源的類器官形成，同時(shí)S100A8/A9 和 SERPINB3 的表達(dá)也下降 (c, d)。這些結(jié)果提示 FABP5 可能不僅是 MP6 細(xì)胞的標(biāo)志基因，可能同樣參與MP6 state的獲得和維持。
此外，在多種細(xì)胞系中敲除或藥物抑制FABP5 均顯著降低了 TGFβ 的表達(dá)，尤其是 TGFβ2 isoform。其下游信號(hào)通路分子表達(dá)也下降 (Fig. 7e–h and Extended Data Fig. 10h,i)。因此，MP6 tumors中 TGFβ 的產(chǎn)生和下游信號(hào)至少部分通過FABP5介導(dǎo)。接著，作者使用有或沒有 FABP5 knockout (ko-FABP5)的TC-1腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞系(L929 cells)進(jìn)行了培養(yǎng)。Parental TC-1 細(xì)胞的上清刺激了 L929 成纖維細(xì)胞向免疫抑制CAF樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，同時(shí)其 TGFβ-inducible genes, 包括 LRRC15, POSTN, BMP7 和 ID1/3 的表達(dá)上升。而ko-FABP5 細(xì)胞培養(yǎng)的成纖維，這些基因的表達(dá)顯著下降 (Fig. 7i)。這些結(jié)果提示 MP6 tumors produce FABP5-dependent TGFβ activity promoting CAF state transition to drive immune exclusion。
最后，作者探究了是否在體內(nèi)抑制 FABP5可以影響腫瘤生長(zhǎng)和T細(xì)胞浸潤(rùn)。與預(yù)期一致，F(xiàn)ABP5-IN-1 顯著降低了腫瘤負(fù)荷，增加了CD4和CD8T細(xì)胞浸潤(rùn) (Fig. 7j–l and Extended Data Fig. 10j,k)。此外，ko-FABP5 在C57BL/6 鼠（而不是免疫缺陷BALBc裸鼠）中幾乎完全阻止了腫瘤形成 (except for mouse B1) (Fig. 7m,n and Extended Data Fig. 10l)。盡管腫瘤在 B1 中生長(zhǎng)，其 CD4 和 CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)也顯著更多。這些結(jié)果提示FABP5 在介導(dǎo) immune exclusion 中存在重要作用。

Fig 7

綜上所述，該研究利用空間多組學(xué)包括單細(xì)胞RNA測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間蛋白質(zhì)組學(xué)，系統(tǒng)地描繪了CSCC腫瘤的高分辨空間圖譜。探索了CSCC的腫瘤異質(zhì)性，為其他鱗狀惡性腫瘤的研究提供了基礎(chǔ)。同時(shí)，揭示了CSCC中MP6狀態(tài)腫瘤通過FABP5介導(dǎo)的TGFβ信號(hào)通路重塑免疫微環(huán)境并逃避免疫的機(jī)制，為宮頸癌和鱗狀細(xì)胞癌的免疫聯(lián)合治療提供了潛在靶點(diǎn)和依據(jù)，也為空間多組學(xué)解析腫瘤免疫微環(huán)境復(fù)雜性提供了有力研究范式。

思路：

1. 發(fā)現(xiàn)特異性腫瘤模塊（單細(xì)胞數(shù)據(jù)）
   part 1：總體單細(xì)胞圖譜+細(xì)胞注釋
   part 2-3：對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行NMF得到3個(gè)重要腫瘤細(xì)胞表達(dá)模式：MP6 (Epi-cytokeratin) ，MP7 (Epi-Imm) 和MP8 (Epi-Sen)。且MP6和MP7與免疫微環(huán)境中顯著TIME相關(guān)。
2. MP6和MP7與TIPs之間存在密切關(guān)系（空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)）
   part 4：使用空轉(zhuǎn)的數(shù)據(jù)將腫瘤樣本分為三種TIP (tumor immune phenotype)：infiltrated TIP、excluded TIP和desert TIP。而 the excluded/desert CSCCs 存在更高比例的 MP6 細(xì)胞，而且infiltrated CSCC 存在更高比例的 MP7 細(xì)胞。
   part 5：空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提示MP6和MP7在空間上互斥。
   part 6：而且作者發(fā)現(xiàn)的免疫相關(guān)MP7與此前的immune-hot存在差別
3. MP6周圍的myCAF存在顯著TGFβ活化，介導(dǎo)免疫抑制（空間蛋白組數(shù)據(jù)）
   part 7：空間蛋白組數(shù)據(jù)結(jié)合單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組提示MP6存在TGFβ信號(hào)激活，且其活化主要位于腫瘤邊緣區(qū)。且MP6特異性基因在immune poor ROI中更高。
   part 8：?jiǎn)渭?xì)胞對(duì)成纖維的亞群細(xì)分提示免疫抑制性CAF-MMP11（也就是myCAFs）存在顯著TGFβ活化，結(jié)合空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)提示myCAF主要位于MP6 spot周圍。
4. MP6/7的臨床意義
   part 9：配對(duì)RNAseq隊(duì)列+治療隊(duì)列的緩解情況
5. MP6特征基因FABP5的作用（類器官+敲除鼠+抗體治療）