Hepatic stellate cell activation promotes alcohol-induced steatohepatitis through Igfbp3 and SerpinA12
Title: Hepatic stellate cell activation promotes alcohol-induced steatohepatitis through Igfbp3 and SerpinA12
Journal: Journal of hepatology
Date: 2020
IF: 20.582
Doi: 10.1016/j.jhep.2020.02.005
文獻(xiàn)指數(shù)：????????
【Abstract】
背景: 脂肪性肝炎（Steatohepatitis）在酒精相關(guān)肝疾病中促進(jìn)纖維形成。最近研究顯示HSCs可能調(diào)節(jié)肝纖維化之前的薄壁細(xì)胞損傷和炎癥，盡管其機(jī)制還未完全闡明。NRP-1和synectin是參與HSCs激活的膜蛋白。在本研究中，我們通過(guò)破壞NRP-1和synectin作為模型來(lái)評(píng)估小鼠酒精喂養(yǎng)后HSCs活化對(duì)脂肪性肝炎發(fā)展的作用。
方法 HSCs細(xì)胞經(jīng)選擇性敲除NRP-1或者synectin的小鼠，喂養(yǎng)對(duì)照飲食或者慢性/酗酒喂養(yǎng)模式。檢測(cè)脂肪肝和炎癥相關(guān)的標(biāo)志蛋白。
結(jié)果 敲除NRP-1的小鼠表現(xiàn)為更少的纖維化、炎癥以及脂肪變性，肝甘油三酯含量降低。敲除synectin的小鼠也得到了類(lèi)似的結(jié)果。使用來(lái)源于條件敲除小鼠肝中的HSCs培養(yǎng)上清處理肝細(xì)胞與正常細(xì)胞上清相比，能夠減少酒精誘導(dǎo)的脂滴形成。從NRP-1敲除的HSCs上清液中脂肪因子和炎癥蛋白陣列顯示Igfbp3顯著降低，SerpinA12表達(dá)上調(diào)。重組Igfbp3誘導(dǎo)脂滴形成，甘油三酯累積和肝細(xì)胞脂肪生成基因表達(dá)。然而，SerpinA12可以保護(hù)酒精誘導(dǎo)的肝脂肪變性。最后，在酒精性肝炎患者的血清盒肝組織中檢測(cè)到Igfbp3表達(dá)上調(diào)，SerpinA12的表達(dá)下調(diào)。
結(jié)論 選擇性敲除HSCs中的NRP-1可以通過(guò)調(diào)節(jié)Igfbp3和SerpinA12信號(hào)通路減弱酒精誘導(dǎo)的脂肪性肝炎。
【Results】
選擇性敲除NRP-1導(dǎo)致的HSCs細(xì)胞激活受損減少了乙醇(EtOH)誘導(dǎo)的纖維化、炎癥和脂肪變性
建立條件敲除NRP-1的 小鼠模型，在HSCs細(xì)胞中敲除NRP-1。通過(guò)WB和TGF-b刺激實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證敲除的效果。NRP-1敲除之后，HSCs激活情況下調(diào)了（a-sma和Collagen I的mRNA水平下調(diào)）。然后建立酒精性脂肪肝的模型，用天狼星紅染色，檢測(cè)纖維化，發(fā)現(xiàn)敲除NRP-1后纖維化水平下調(diào)了，a-Sma，Col1a1和Timp-1的mRNA水平都下調(diào)了。
基于HSCs可能調(diào)節(jié)脂肪變性和炎癥促進(jìn)肝纖維化的假設(shè)，我們想要知道選擇性的敲除HSCs的NRP-1是否能夠保護(hù)酒精引起的脂肪變性和炎癥。對(duì)照小鼠飼喂慢性/暴酒精，表現(xiàn)出明顯的脂肪變性，相對(duì)于正常飲食組，而敲除NRP-1的小鼠表現(xiàn)出酒精誘導(dǎo)的脂肪變性的保護(hù)作用【通過(guò)Oil-red O染色結(jié)果展示】；同時(shí)再NRP-1敲除的小鼠中甘油三脂的含量下調(diào)了50%。炎癥因子（Tnf-a, Il-1b和Mcp-1）的mRNA水平在對(duì)照組中升高了，而敲除NRP-1組卻沒(méi)有。肝組織CD68染色，以顯示巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)也的到了類(lèi)似的結(jié)果。炎癥病灶量化結(jié)果（flammatory foci quantification）也是一致的。
<u>這部分用到的實(shí)驗(yàn)：</u>首先是條件敲除NRP-1的小鼠模型和HSCs細(xì)胞，然后建立酒精性脂肪肝的模型。天狼星紅染色檢測(cè)纖維化，mRNA水平檢測(cè)想纖維化指標(biāo)，炎癥指標(biāo)，油紅染色檢測(cè)脂質(zhì)形成，甘油三脂含量檢測(cè)，肝組織CD68檢測(cè)局勢(shì)細(xì)胞浸潤(rùn)和HE染色檢測(cè)炎癥病灶。
ColCre/Nrp1loxP小鼠HSCs細(xì)胞來(lái)源的上清可以減少乙醇暴露的肝細(xì)胞的脂滴形成
通過(guò)觀察HSCs選擇性敲除NRP-1可預(yù)防酒精性脂肪變性，假設(shè)HSCs能夠產(chǎn)生NRP-1依賴(lài)的旁分泌信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)桿脂肪變性。
從條件敲除小鼠中分離培養(yǎng)敲除NRP-1的HSCs細(xì)胞。收集培養(yǎng)上清添加不同濃度的酒精，處理原代肝細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)脂滴形成是減少的【通過(guò)BODIPY染色】。然后在人細(xì)胞中敲除NRP-1，將肝細(xì)胞放在底部，HSCs放在上室的間接共培養(yǎng)的方法。然后暴露與酒精，并檢測(cè)脂滴形成。然后也分離人的HSCs來(lái)實(shí)驗(yàn)也得到了類(lèi)似的結(jié)果。
NRP-1敲除的HSCs細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中Igfbp3表達(dá)降低，SerpinA12表達(dá)增加
取NRP-1敲除HSCs細(xì)胞的上清做adipokine and inflammatory protein array（脂肪因子和炎癥蛋白陣列），檢測(cè)到Igfbp3表達(dá)相對(duì)于對(duì)照降低了4.4倍，而SerpinA12增加了2.4倍。然后進(jìn)行了qPCR和上清WB的驗(yàn)證。
重組Igfbp3增加體外肝細(xì)胞脂滴形成、甘油三酯含量和脂肪基因表達(dá)
用重組Igfbp3可以促進(jìn)脂滴的形成，效果和酒精處理類(lèi)似，并且兩者具有協(xié)同的效果【通過(guò)BODIPY染色以及甘油三脂含量檢測(cè)】。
Igfbp3通過(guò)src激酶信號(hào)增強(qiáng)原代肝細(xì)胞中的p-Akt
Igfbp3重組蛋白處理小鼠后，小鼠肝細(xì)胞中p-Akt增加了6.2倍。IGF-1R和Erk沒(méi)有明顯變化
SerpinA12處理可通過(guò)p-AMPK途徑預(yù)防乙醇誘導(dǎo)的脂肪變性
SerpinA12重組蛋白處理小鼠，發(fā)現(xiàn)被酒精處理導(dǎo)致的p-MAPK下調(diào)又上升了，而這種作用能夠被MAPK抑制劑所抑制。
酒精性肝病患者血清和肝組織中Igfbp3升高，SerpinA12降低
【Discussion】
激活的HSCs促進(jìn)Igfbp3和降低serpinA12的釋放，以旁分泌的效果作用于肝細(xì)胞，Igfbp3通過(guò)整合素受體促進(jìn)p-akt信號(hào)通路，導(dǎo)致脂滴形成，甘油三酯含量增加，脂肪生成基因表達(dá)；乙醇降低p-AMPK，促進(jìn)脂生成。SerpinA12通過(guò)促進(jìn)p-AMPK抵抗酒精誘導(dǎo)的脂肪變性。
HSCs不僅調(diào)節(jié)纖維化，而且能夠調(diào)節(jié)脂肪變性。HSCs產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，作為抗原呈遞細(xì)胞。激活的HSCs可以釋放IL-6和TNF-a，抑制HNF1a和SHP-1導(dǎo)致炎癥和纖維化。
【Evaluation】
這篇文章主要是通過(guò)NRP-1和synectin條件敲除的HSCs以及建立的酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)敲除NRP-1導(dǎo)致了Igfbp3的表達(dá)下調(diào)和serpinA12釋放增加，這兩者均減輕了酒精導(dǎo)致的脂肪變性和炎癥，緩解了脂肪肝；而在真實(shí)的酒精性脂肪肝患者體內(nèi)檢測(cè)到這兩個(gè)分子的表達(dá)變化。其重要意義在于一定程度上解釋了酒精性脂肪肝的形成，以及潛在標(biāo)志蛋白發(fā)現(xiàn)。沒(méi)有解釋的問(wèn)題有：很難證明Igfbp3和SerpinA12在酒精性脂肪性肝炎發(fā)展中的因果關(guān)系。ColCre的敲除策略可以不是HSCs特異性的。
