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多重耐藥肺炎克雷伯菌ST15單質(zhì)粒載體毒力與多重耐藥的融合
Clinically relevant mutations in core metabolic genes confer antibiotic resistance
作者：Allison J. Lopatkin等
期刊：Science
時間：2019.2.15
影響因子：41.845
DOI： 10.1126/science.aba0862
高通量測序方法：使用Illumina HiSeq 2500 進行基因組測序
主要的研究方法：
使用3種抗生素[streptomycin (strep), ciprofloxacin (Cipro), and carbenicillin (carb)]對大腸桿菌BW25113菌株進行經(jīng)典的進化選擇（選取最后抗生素濃度最高時存活下的菌株，進行基因組測序，接著進行l(wèi)arge indels、SNPs、KEGG代謝功能進行分析），然后使用行代謝依賴的方法進行抗生素進化選擇，接著進行基因遺傳分析，最后使用基因敲出的方法進行驗證。
主要的結(jié)果：
1 Identifying genetic changes associated with antibiotic resistance
經(jīng)Cipro處理的克隆中，92%的克隆在藥物靶點（由gyrA或gyrB編碼）有突變，100%的克隆在rob中獲得突變，rob編碼一種已知的多藥耐藥和應(yīng)激的全球轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子回應(yīng)。兩個克隆（16.7%）在icd中有突變，icd編碼一種核心代謝酶，參與三羧酸（TCA）過程中氧化異檸檬酸循環(huán)。
在施加抗生素的條件下，大腸桿菌的經(jīng)典進化示意圖和特征描述，A 圖描述了大腸桿菌的進化方案；B圖描述了在抗生素的條件下的細(xì)菌的存活狀況；C圖描述了在存活率開始下降的后五天每個樣本的最早死亡的時間節(jié)點（用第五天保存的菌株進行復(fù)蘇）；D圖描述了克隆單體與菌群的生長狀況；E圖描述了在最低抑制濃度的菌株的生長狀況；F圖展示了測序樣本的選擇 ；G、H 圖描述了SNP 與 indels等突變情況；I描述了三種抗生素相關(guān)基因SNP突變的數(shù)目；L描述了KEGG功能注釋的情況
2 Evolving antibiotic resistance using a metabolic-dependent approach
以溫度來控制代謝活動，每天整加1攝氏度，來講進行抗生素的進化選擇；下圖結(jié)果表明，存活率的增加是由于獲得性抗性，而不是由于延遲耐受（圖2D-F)。盡管最低培養(yǎng)基的MIC在群體水平上沒有增加，對96個個體克隆的分析顯示，與祖先菌株相比，平均而言，分離株表現(xiàn)出MIC增加（圖2G)。
3Knockout and overexpression confirm genetic underpinnings of antibiotic resistance
為了評估這些代謝突變是否產(chǎn)生耐藥性，我們根據(jù)其患病率和臨床意義（圖3A），我們選擇了與代謝相關(guān)的基因（sucA，gltD，ushA，icd，ycgG和yidA）和經(jīng)典抗性（ompF，acrD和gyrA）的代表性子集。代謝突變使MIC增加到至少一種抗生素，而且在許多情況下超過一種抗生素（圖3B）,在所有情況下，代謝突變體至少對抗生素的一種耐藥，與相應(yīng)的MIC一致水平,這表明，代謝突變可能影響表達(dá)水平和/或催化活性，而不是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能，盡管這種機制效應(yīng)并不明顯?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，這些臨床相關(guān)的代謝變異確實具有耐藥性。眾所周知，抗生素刺激的代謝活動導(dǎo)致有毒代謝物質(zhì)的形成。因此，我們推斷耐藥性可能源于多種策略之一，包括降低對氧化應(yīng)激的敏感性或防止抗生素誘導(dǎo)的三羧酸(TCA)循環(huán)的刺激。為了研究這些可能性，我們重點研究了sucA(sucAM)中的代謝突變，它對碳水化合物具有高水平的保護作用。我們使用RNA測序來比較存在或不存在carb處理時sucAM和WT之間的基因表達(dá)差異.與WT細(xì)胞相比，WT細(xì)胞對carb和近300個差異表達(dá)基因表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)變（DEGs），SUCAM與其未經(jīng)處理的對照沒有區(qū)別，只有17DEGs。層次聚類和基于KEGG的途徑分析揭示了兩種明顯的表型：響應(yīng)carb的WT代謝基因顯著上調(diào)（P<0.05，F(xiàn)isher精確檢驗）和核心代謝途徑中的整體下調(diào)活性，例如SUCAM中的中樞和能量代謝。
綜合起來，這些結(jié)果表明，這種抗性可能通過繞過carb介導(dǎo)的TCA活化而發(fā)生，可能與較低的總體基礎(chǔ)呼吸速率有關(guān)。
主要結(jié)論：
典型的耐藥機制通常僅分為三大類：靶向修飾，藥物失活和藥物轉(zhuǎn)運。該篇研究結(jié)果表明，代謝突變是對抗生素治療產(chǎn)生的，并且這些突變賦予了耐藥性并且這種現(xiàn)象在臨床病原體中非常普遍。實際上，代謝適應(yīng)可以代表一類抗性機制，其中除了賦予耐受性之外，細(xì)胞改變其代謝反應(yīng)以減輕抗生素致死性的下游毒性方面。沿著這個思路，即使是經(jīng)典的突變，例如調(diào)節(jié)元件或外排系統(tǒng)中的突變，也出現(xiàn)在經(jīng)典進化和代謝進化中；這些突變是否出現(xiàn)是因為它們降低了結(jié)合靶標(biāo)的濃度或使隨后的應(yīng)激反應(yīng)最小化尚不清楚。然而，已知的是，體內(nèi)抗生素動力學(xué)變化很大，很少遵循簡單的連續(xù)梯度。因此，實施新的方案以增加可獲得的進化途徑可以促進新的抗性機制的發(fā)現(xiàn)，從而增強我們限制抗生素抗性發(fā)展和傳播的能力。
綜上所述為：在抗生素治療中，發(fā)生代謝突變，其賦予了細(xì)菌耐藥性；細(xì)菌通過代謝適應(yīng)機制，改變一些代謝反應(yīng)，從而抵抗抗生素對其的毒力傷害。
