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前言

在生發(fā)中心（Germinal Center，GC）形成的過程中，濾泡輔助性T（T follicular helper，Tfh)細(xì)胞承擔(dān)著重要的角色。最初，科學(xué)家們基于其特異性高表達(dá)CXCR5鑒定Tfh；隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Tfh細(xì)胞還高表達(dá)PD-1、ICOS以及BTLA，卻不表達(dá)常見于T細(xì)胞的標(biāo)識分子CD62L、CCR7和PSGL1，因而研究者們提出將Tfh與其他輔助性T細(xì)胞亞群進(jìn)行區(qū)分的觀點。2009年，Bcl6被確定為Tfh細(xì)胞的特異性譜系轉(zhuǎn)錄因子。然而，Tfh細(xì)胞的不同亞群在表型和功能上并不完全一致，雖然已經(jīng)有研究揭示了其組成的異質(zhì)性，但仍需進(jìn)一步深入分析及驗證。

記憶T細(xì)胞是免疫應(yīng)答后的產(chǎn)物，這些細(xì)胞在無進(jìn)一步抗原刺激下依舊可以存活并進(jìn)行自我更新。基于其表面分子的表達(dá)及功能的異質(zhì)性，記憶T細(xì)胞可分為中樞記憶（Tcm）、效應(yīng)記憶（Tem）以及組織駐留記憶（Trm）T細(xì)胞。Tem細(xì)胞表達(dá)歸巢受體并能分泌多種細(xì)胞因子；而Tcm細(xì)胞很少分泌效應(yīng)細(xì)胞因子，但高表達(dá)CD62L和CCR7；Trm細(xì)胞則表達(dá)CD103及CD69，并特異性定位于炎癥組織中。近來，通過對慢性感染及腫瘤模型的研究，研究者們已經(jīng)確定了一種具有干細(xì)胞特性的CD8⁺ T細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)其對腫瘤治療中的免疫檢查點阻斷療法異常敏感，從而成為了潛在的免疫治療靶點。然而，對于CD4⁺ T細(xì)胞亞群還未得到充分研究，特別是其中的Tfh細(xì)胞，對其是否、何時以及如何產(chǎn)生記憶細(xì)胞知之甚少。

本研究通過對幾種處理條件下產(chǎn)生的CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）分析。結(jié)果顯示除了已表征的PD-1^hi效應(yīng)Tfh細(xì)胞亞群外，還有一個CD62L⁺PD-1^low亞群，它們獨立于PD-1⁺細(xì)胞發(fā)育，不與B細(xì)胞直接接觸。更重要的是，CD62L⁺ Tfh細(xì)胞表達(dá)記憶和干細(xì)胞相關(guān)基因，且具有更好的長期存活率，在再次免疫反應(yīng)中也更容易產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞。因此，本項研究揭示了Tfh細(xì)胞的異質(zhì)性，并為記憶Tfh細(xì)胞的發(fā)育和調(diào)節(jié)提供了新的見解。

主要內(nèi)容

一、scRNA-seq分析揭示Tfh細(xì)胞的異質(zhì)性

首先，作者使用10x單細(xì)胞測序平臺，基于CD4⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6-RFP⁺Foxp3-GFP^-B220^-圈門策略，對從KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP報告小鼠中分離的活Tfh細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq測序。對數(shù)據(jù)進(jìn)行串聯(lián)及質(zhì)控后，總共捕獲了5410個細(xì)胞，每個細(xì)胞具有1251個中位基因。通過無監(jiān)督聚類確定了10個主要的細(xì)胞群（圖1A），進(jìn)一步通過差異表達(dá)基因（DEGs）對每個細(xì)胞簇進(jìn)行定義，簇1（C1）高表達(dá)經(jīng)典的Tfh細(xì)胞標(biāo)記基因，包括Pdcd1、Lag3、Hif1a、Tox、Il21、Cxcr5和Tox2，表現(xiàn)出常規(guī)效應(yīng)Tfh細(xì)胞的特征。Sell⁺中樞記憶樣（C3）、Ifit1⁺干擾素刺激（C6）、Stmn1⁺高度增殖（C5和C7）Tfh細(xì)胞亞群以前未被鑒定。由于特異性譜系轉(zhuǎn)錄因子的缺乏，未對C0和C2簇進(jìn)行定義（圖1A）。C8和C9簇可能分別是巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，也被排除在進(jìn)一步分析之外。值得注意的是，Pdcd1和Sell在Tfh細(xì)胞中的表達(dá)是相互排斥的。Pdcd1主要表達(dá)于C1、C5和C7簇中，在C3簇中幾乎沒有檢測到，而Sell在C3和C6簇中高度表達(dá)。

接下來，作者進(jìn)一步分析C1（Pdcd1^hi）和C3（Sell^hi）中的DEGs。C1高表達(dá)許多以前被表征為在Tfh細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)揮功能中具有重要地位的基因，因此其可能代表效應(yīng)Tfh細(xì)胞。而C3則高表達(dá)與記憶T細(xì)胞形成相關(guān)、參與細(xì)胞定位和遷移、抗凋亡、細(xì)胞周期抑制以及與干細(xì)胞相關(guān)的基因（圖1C）。證實了Bcl6⁺ Tfh細(xì)胞可能具有異質(zhì)性。

為進(jìn)一步檢測這些細(xì)胞的異質(zhì)性的產(chǎn)生并不僅限于KLH免疫，作者利用相同的圈門策略，從流感感染小鼠的引流淋巴結(jié)和na?ve小鼠的派爾斑(Peyer’s Patches, PP)中提取Tfh細(xì)胞，并進(jìn)行scRNA-seq測序。同時通過CD4⁺CXCR5⁺Bcl6-RFP⁺Foxp3-GFP⁺門控策略對從KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP報告小鼠中分離的濾泡調(diào)節(jié)性細(xì)胞(Tfr)進(jìn)行類似研究。UMAP分析揭示，在KLH免疫模型中，Tfh和Tfr的細(xì)胞亞群大體保持一致（圖1D）。與KLH免疫模型和流感感染模型相比較，PP模型中的Tfh細(xì)胞展現(xiàn)出相對較高豐度的C1以及較低豐度的C3（圖1D）。此外，源于KLH免疫模型的Tfr細(xì)胞的C4簇是特異性存在的，在三種模型的Tfh細(xì)胞中均未被發(fā)現(xiàn)，且高表達(dá)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能有關(guān)的基因（圖1D）。

為了驗證上述scRNA-seq分析的結(jié)果，作者通過流式細(xì)胞術(shù)分析了KLH免疫小鼠引流淋巴結(jié)中CD4⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細(xì)胞表面PD-1和CD62L蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)60%的GC-Tfh細(xì)胞表達(dá)PD-1，25%的GC-Tfh細(xì)胞表達(dá)CD62L（圖1E、F），并且在另外兩種模型中觀察到類似的細(xì)胞分布模式（圖1E、F）。

二、CD62L+Tfh細(xì)胞百分比隨免疫應(yīng)答進(jìn)展而增加

上述生物信息學(xué)分析揭示了CD62L⁺ Tfh細(xì)胞亞群的存在。為了進(jìn)一步表征這些細(xì)胞，作者在不同時間點，對KLH免疫后的B6小鼠中的Tfh細(xì)胞進(jìn)行分析顯示，PD-1⁺ Tfh細(xì)胞是免疫反應(yīng)早期階段的主要細(xì)胞群（圖2A-C），而CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的百分比隨著時間的推移而增加（圖2A-C），表明它們可能代表記憶細(xì)胞。作者還使用OT-II TCR轉(zhuǎn)基因小鼠模型，分析了抗原特異性Tfh細(xì)胞。與KLH免疫模型相似，轉(zhuǎn)移到CD45.1受體小鼠中的na?ve OT-II T細(xì)胞在OVA免疫后發(fā)育成PD1⁺和CD62L⁺Tfh細(xì)胞群（圖2D-F）。不同的是，PD-1+與CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的百分比在免疫反應(yīng)早期增加，在免疫反應(yīng)達(dá)到峰值后均降低（圖2F）。另外，可能由于scRNA-seq靈敏度的限制，Tfh細(xì)胞中的Bcl6轉(zhuǎn)錄因子并沒有被很好的檢測到，于是作者對Bcl6進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，發(fā)現(xiàn)CD62L⁺ Tfh細(xì)胞和PD-1⁺ Tfh細(xì)胞中的Bcl6蛋白表達(dá)水平是相當(dāng)?shù)模▓D2G、H）。同時，在CD62L⁺ Tfh細(xì)胞和PD-1⁺ Tfh細(xì)胞之間，Bcl6基因座的總?cè)旧|(zhì)可及性沒有顯著差異（圖2I）。綜上所述，可以將在scRNA-seq中發(fā)現(xiàn)的CD62L⁺ Tfh細(xì)胞確定為真正的Tfh細(xì)胞。

三、CD62+ Tfh細(xì)胞不是來源于表達(dá)IL-21的PD-1+ Tfh細(xì)胞

為了分析CD62L⁺ Tfh細(xì)胞是否隨著細(xì)胞分裂而發(fā)育，作者將來自Bcl6^RFP×Foxp3^GFP×OT-II小鼠中CFSE標(biāo)記的na?ve OT-II T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到CD45.1轉(zhuǎn)基因小鼠中，并用OVA蛋白進(jìn)行免疫。結(jié)果顯示，在OVA免疫后細(xì)胞分裂三次以上可檢測到CD45.2⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細(xì)胞，進(jìn)而可檢測其表面PD-1和CD62L的表達(dá)。可以觀察到Tfh細(xì)胞隨著細(xì)胞分裂同時獲得PD-1和CD62L表達(dá)（圖3A、B），表明CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh細(xì)胞在免疫反應(yīng)的早期階段同時產(chǎn)生。作者進(jìn)一步探索CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的發(fā)育軌跡，這群細(xì)胞是否來自PD-1⁺ Tfh細(xì)胞。在進(jìn)一步的分析中，作者使用了一種新的IL21命運映射小鼠。首先，對KLH免疫后的IL21^VFP報告小鼠進(jìn)行分析，作者證實了PD-1與IL-21在CXCR5⁺細(xì)胞中共表達(dá)（圖3C、D）。隨后，通過利用新的IL21^creRosa^YFP譜系追蹤小鼠，作者發(fā)現(xiàn)在KLH免疫后的免疫收縮期（第21天），記憶CD62L⁺ Tfh細(xì)胞不表達(dá)IL-21（圖3C、E），表明大多數(shù)記憶CD62L⁺ Tfh細(xì)胞不是來源于表達(dá)IL-21的PD-1⁺ Tfh細(xì)胞。同時，作者還觀察到一部分CD62L⁺ Tfh細(xì)胞在早期即表達(dá)中等水平的IL-21，但在免疫收縮期沒有檢測到這些細(xì)胞（圖3C），這表明它們壽命不長，可能不能作為Tfh的記憶前體細(xì)胞。另外，通過RNA速率分析，作者觀察到從Sell^hi到Pdcd1^hi Tfh細(xì)胞的發(fā)育軌跡（圖3F）。

為了更好地表征CD62L⁺ Tfh細(xì)胞，作者對KLH免疫后產(chǎn)生的PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細(xì)胞進(jìn)行了TCR克隆型分析，以na?ve T細(xì)胞作為對照。結(jié)果顯示，na?ve T細(xì)胞和Tfh細(xì)胞的兩個亞群之間的TCR克隆型是不同的（圖3G）。值得注意的是，CD62L⁺和PD1⁺ Tfh細(xì)胞共享許多TCR序列，這表明PD1⁺和CD62L⁺細(xì)胞來源于相同的祖細(xì)胞（圖3G）。這與OT-II T細(xì)胞獲得的結(jié)果一致，均提示抗原特異性CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh細(xì)胞的產(chǎn)生是一個隨機過程。然而，仍然有一部分CD62L⁺ Tfh細(xì)胞攜帶獨特的TCR（圖3G），可能是這些CD62L⁺ Tfh細(xì)胞來源于預(yù)先存在的或旁觀記憶T細(xì)胞。隨后，作者進(jìn)一步分析了PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細(xì)胞之間共享的TCR β序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些TCR序列在兩組細(xì)胞之間顯示出不同的分布（圖3H、I），這表明TCR信號可能影響PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的發(fā)育。

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四、表達(dá)CD62L的Tfh細(xì)胞不優(yōu)先與B細(xì)胞接觸

Tfh細(xì)胞是一類專門協(xié)助B細(xì)胞分化發(fā)育的輔助T細(xì)胞，其對B細(xì)胞濾泡生發(fā)中心反應(yīng)和高親和力抗體的產(chǎn)生至關(guān)重要。因此，作者隨后比較了表達(dá)PD-1和CD62L的Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞的結(jié)合情況。對來自KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP報告小鼠（圖4A）中與B細(xì)胞結(jié)合的Tfh細(xì)胞進(jìn)行分選，提示大多數(shù)B細(xì)胞結(jié)合的Tfh細(xì)胞是PD-1⁺，而幾乎不表達(dá)CD62L（圖4 B），表明CD62L⁺ Tfh細(xì)胞不優(yōu)先與B細(xì)胞接觸。然而，隨后作者觀察到表達(dá)PD-1和CD62L的Tfh細(xì)胞都需要B細(xì)胞的輔助而產(chǎn)生，因為在KLH免疫的B細(xì)胞缺陷型μMT小鼠中PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細(xì)胞都不存在。這些結(jié)果表明，CD62L⁺ Tfh細(xì)胞雖然不優(yōu)先與B細(xì)胞接觸，但其發(fā)育依賴于B細(xì)胞。為了進(jìn)一步表征CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的細(xì)胞定位，作者進(jìn)行了免疫熒光實驗。通過免疫Bcl6-RFP報告小鼠，我們觀察到與CD62^-Bcl6⁺ T細(xì)胞相比，GC區(qū)域內(nèi)表達(dá)CD62L的Bcl6⁺ T細(xì)胞的比例顯著降低（圖4C、D），表明GC中大多數(shù)Bcl6⁺的CD4 T細(xì)胞很可能表達(dá)PD-1，而缺乏CD62L的表達(dá)。此外，作者對CD62L⁺BCL6-RFP⁺細(xì)胞總體分布的綜合分析闡明了它們主要定位于PNA⁺B220^- GC區(qū)域，在PNA^-B220⁺濾泡套和T細(xì)胞區(qū)僅稀疏存在（圖4E）。

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五、CD62L+Tfh細(xì)胞表現(xiàn)出記憶細(xì)胞的特征

為了更好地分析CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的特征，作者基于前述的scRNA-seq結(jié)果比較了Pdcd1^hi細(xì)胞簇（C1）和Sell^hi細(xì)胞簇（C3）的DEGs。結(jié)果表明，Sell^hi簇中特異性表達(dá)的基因與干細(xì)胞和細(xì)胞周期有關(guān)的途徑相關(guān)性高（GO：0019827；GO：0035019），但與參與mTCRC1信號傳導(dǎo)和糖酵解過程的基因相關(guān)性較低（圖5A）?；蚪M富集分析（GSEA）也揭示了CD62L⁺ Tfh細(xì)胞在與Wnt、Notch和Hedgehog信號通路相關(guān)的基因集上顯著富集，而PD-1⁺Tfh細(xì)胞在與細(xì)胞周期、凋亡和氧化磷酸化相關(guān)的基因集上顯著富集（圖5B）。

接下來作者進(jìn)一步驗證scRNA-seq的分析結(jié)果，作者比較了CD62L+和PD-1⁺ Tfh細(xì)胞的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，與scRNA-seq數(shù)據(jù)一致，與PD-1⁺ Tfh細(xì)胞相比，CD62L⁺ Tfh細(xì)胞表現(xiàn)出與抗凋亡和淋巴細(xì)胞遷移相關(guān)的基因表達(dá)增加，與細(xì)胞周期和Tfh效應(yīng)功能相關(guān)的基因表達(dá)減少（圖5D）。

為了了解PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh在表觀遺傳水平上是否不同，作者使用ATAC-seq進(jìn)行染色質(zhì)可及性分析?？偟膩碚f，CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的總開放染色質(zhì)區(qū)明顯少于PD-1⁺ Tfh細(xì)胞。Pdcd1和Sell基因座分別表現(xiàn)在PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細(xì)胞中的可及性增加。對PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細(xì)胞中的開放染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞相關(guān)的基因結(jié)合基序與CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的可及染色質(zhì)區(qū)域密切相關(guān)（圖5F）。相反，與T細(xì)胞效應(yīng)功能相關(guān)的基因結(jié)合基序在PD-1⁺ Tfh細(xì)胞中富集（圖5G）。

隨后，作者驗證了CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的記憶和干細(xì)胞樣特征，將來自O(shè)VA免疫的CD45.1小鼠的CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至接受了na?ve CD4⁺ T細(xì)胞的Bcl6^RFP×Foxp3^GFPOT-II轉(zhuǎn)基因小鼠（圖6A、B）。在無抗原刺激的情況下，PD-1⁺ Tfh細(xì)胞迅速凋亡，CD62L⁺ Tfh細(xì)胞則顯示出較低的細(xì)胞死亡率（圖6B），并隨后遷移到外周淋巴器官中（圖6C）。重要的是，在抗原再次攻擊時（圖6D），CD62L⁺ Tfh細(xì)胞與na?ve Tcells（圖6E）一樣增殖，且增殖迅速。值得注意的是，與所有其他細(xì)胞類型相比，CD62L⁺ Tfh細(xì)胞可更有效地產(chǎn)生次級CXCR5+Bcl6⁺ Tfh，特別是PD-1⁺效應(yīng)Tfh細(xì)胞（圖6E、F）。作者還觀察到，在接受CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的小鼠中，GC B細(xì)胞反應(yīng)、產(chǎn)生抗原特異性抗體更強烈（圖6J-L）。這些觀察結(jié)果表明，CD62L⁺ Tfh細(xì)胞在再次免疫反應(yīng)中反應(yīng)更快，并為B細(xì)胞提供更有效的幫助。

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六、轉(zhuǎn)錄因子KLF2調(diào)控CD62L+Tfh細(xì)胞的發(fā)育

scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，Il7r表達(dá)與Sell相關(guān)，但與Tfh細(xì)胞中Pdcd1表達(dá)無關(guān)（圖1B）。ATAC-seq分析顯示，Il7r基因座在CD62L⁺比在PD-1⁺ Tfh細(xì)胞中更容易接近，表明Il7r是信號傳導(dǎo)、記憶T細(xì)胞產(chǎn)生和維持的重要調(diào)節(jié)因子，且可能有助于CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的調(diào)節(jié)。因此，作者給轉(zhuǎn)移了Bcl6^RFP×Foxp3^GFPOT-II轉(zhuǎn)基因小鼠na?ve CD4+ T細(xì)胞且被OVA免疫的CD45.1受體小鼠施用抗IL7R阻斷抗體。結(jié)果顯示在免疫反應(yīng)的高峰和晚期，IL7R阻斷增加了Tfh細(xì)胞中PD-1的表達(dá)，降低了CD62L的表達(dá)。該數(shù)據(jù)表明IL7R信號調(diào)節(jié)了CD62L⁺PD-1⁺ Tfh細(xì)胞的發(fā)育。

scRNA-seq數(shù)據(jù)同樣顯示，Klf2的表達(dá)被限制在Sell^hi Tfh細(xì)胞中（圖1B）。為了進(jìn)一步理解驗證，作者利用KLF2GFP報告小鼠，發(fā)現(xiàn)KLH免疫后Tfh細(xì)胞中KLF2與CD62L明顯共表達(dá)，但不與PD-1共表達(dá)（圖7A、B）。隨后，作者利用Bcl6^creERT2Klf2^flfl×OT-II小鼠，將其在接受他莫昔芬治療后，特異性敲除Bcl6⁺ Tfh細(xì)胞中的Klf2。將來自Bcl6^creERT2Klf2^flfl×OTII小鼠的na?ve OT-II細(xì)胞轉(zhuǎn)移到CD45.1受體小鼠中，隨后進(jìn)行OVA免疫，并在免疫后的第3、5和7天將他莫昔芬或?qū)φ談┯衩子停ㄟ^腹膜內(nèi)注射到受體小鼠中（圖7C）。結(jié)果顯示總CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細(xì)胞百分比不受Klf2缺陷的影響（圖7D），而PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh細(xì)胞都發(fā)生了顯著改變（圖7E）。在KLF免疫的Bcl6^creERT2Klf2^flfl小鼠中也觀察到類似的結(jié)果（圖7F-H），Tfh細(xì)胞中Klf2的缺乏抑制了CD62L⁺ Tfh的發(fā)育，但不影響總的Tfh細(xì)胞群（圖7G、H）。此外，作者觀察到Klf2調(diào)節(jié)CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的功能是劑量依賴性的，因為其在Bcl6^creERT2Klf2^fl/+小鼠中發(fā)揮最小的作用（圖7H）。

此外，作者將來自Bcl6^creERT2Klf2^flflOT2轉(zhuǎn)基因小鼠的na?ve OT-II細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Tcrbd^-/-受體小鼠中，隨后進(jìn)行OVA免疫和他莫昔芬誘導(dǎo)的Klf2缺失處理（圖7I）。在初次免疫后第21天進(jìn)行OVA/IFA再免疫。結(jié)果顯示在他莫昔芬處理的小鼠中，CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細(xì)胞比對照小鼠顯著減少（圖7J、K），特別是PD-1^hi效應(yīng)Tfh細(xì)胞（圖7M）。還觀察到Tfh細(xì)胞中Klf2的缺失導(dǎo)致二次免疫反應(yīng)期間無功能PD-1^-CD62L^- Tfh細(xì)胞的積累（圖7M），同時，GC B細(xì)胞反應(yīng)降低、抗原特異性IgG產(chǎn)生也顯著減少（圖7L、N）。這些結(jié)果表明，表達(dá)Bcl6⁺Tfh細(xì)胞中Klf2的缺失抑制了記憶Tfh細(xì)胞的形成。

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小結(jié)

本篇文章的故事線：Tfh細(xì)胞在GC反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程中占據(jù)了重要地位。然而，Tfh細(xì)胞的不同亞群在表型和功能上并不完全一致。因此，本篇文章旨在揭示Tfh細(xì)胞的異質(zhì)性，并為研究記憶Tfh細(xì)胞的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)提供新的理論支持。

作者首先對在幾種處理條件下產(chǎn)生的CXCR5⁺Bcl6⁺Tfh細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，同時結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示除了已表征的PD-1^hi效應(yīng)Tfh細(xì)胞亞群外，還存在一個CD62L⁺PD-1^low亞群。隨后通過利用不同的小鼠模型，觀察到CD62L⁺Tfh細(xì)胞百分比隨免疫應(yīng)答進(jìn)展而增加；在作者構(gòu)建的發(fā)育軌跡中，CD62⁺ Tfh細(xì)胞不是來源于表達(dá)IL-21的PD-1⁺ Tfh，且它們不優(yōu)先與B細(xì)胞接觸?；蚋患治黾癆TAC-seq分析顯示CD62L⁺ Tfh細(xì)胞對細(xì)胞凋亡具有相對抗性，并且具有干細(xì)胞樣表型，還可以有效地產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞來響應(yīng)二次免疫反應(yīng)。

最后，聚焦于轉(zhuǎn)錄因子對CD62L⁺ Tfh細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控，在scRNA-seq分析的基礎(chǔ)上，建立klf2缺陷的小鼠模型，證實了在CD62L⁺ Tfh細(xì)胞中特異性表達(dá)的Klf2是這些細(xì)胞產(chǎn)生發(fā)育過程中所必需的。

研究觀點：此項研究基于對三種不同處理條件下產(chǎn)生的CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq分析，揭示了CD62L⁺亞群的存在。隨后，研究整體建立在逐步深入的生信數(shù)據(jù)分析結(jié)果之上，并開展相關(guān)動物實驗進(jìn)行驗證。一方面為記憶Tfh細(xì)胞的發(fā)育及調(diào)控進(jìn)行了驗證，另一方面通過結(jié)合bulk RNA-seq、ATAC-seq分析，觀察到CD62L⁺ Tfh細(xì)胞表達(dá)記憶和干細(xì)胞相關(guān)基因，且在再次免疫反應(yīng)中也更容易產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞。總的來說，文章從CD62L⁺亞群的發(fā)生、發(fā)育及功能各個方面講述了一個比較完整的故事。