前期記錄

先確定目標(biāo)基因
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（1）
然后對(duì)目的基因進(jìn)行背景調(diào)查
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（2）磨刀不誤砍柴工
設(shè)計(jì)sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA設(shè)計(jì)好之后
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（3）sgRNA及引物設(shè)計(jì)
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（4）構(gòu)建sgRNA+Cas9載體
轉(zhuǎn)染驗(yàn)證
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（5）293FT細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗(yàn)證 and trouble shooting

事實(shí)上，在轉(zhuǎn)染驗(yàn)證結(jié)束后，對(duì)于癌細(xì)胞等易轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，基本上可以立刻進(jìn)行轉(zhuǎn)染，如果載體帶有熒光，則根據(jù)熒光篩選陽性細(xì)胞，若載體為抗生素抗性，而經(jīng)過抗生素篩選后可直接進(jìn)行下一步單克隆細(xì)胞篩選。對(duì)于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，可使用電轉(zhuǎn)或者特殊的轉(zhuǎn)染試劑，再根據(jù)熒光或者抗性篩選。
將細(xì)胞消化過篩后種96孔板，每孔種一個(gè)細(xì)胞，前提是要有活細(xì)胞工作站，可以定時(shí)拍照1星期以上，從而確定單細(xì)胞克隆，如果沒有這樣的儀器，網(wǎng)絡(luò)上還有其他篩選單細(xì)胞的教程，比如稀釋法等等（我覺得直接種1孔1個(gè)細(xì)胞就OK，種完就找到得力的顯微鏡全孔拍攝）?？偠灾Y選單細(xì)胞這一步依賴于實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)的條件。
我已經(jīng)在前兩周完成了轉(zhuǎn)染+熒光篩選+擴(kuò)增凍存一部分，目前種板準(zhǔn)備篩選單細(xì)胞克隆。由于我養(yǎng)的細(xì)胞屬于非常難轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，使用了特殊的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染過后細(xì)胞不耐受，熒光篩選之后更加脆弱，實(shí)驗(yàn)周期相應(yīng)拉長。注意，最遲最遲在確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后開始訂購所需的驗(yàn)證性抗體。實(shí)驗(yàn)并非一個(gè)人可以完成，這和實(shí)驗(yàn)室的管理，補(bǔ)給，運(yùn)營還有實(shí)驗(yàn)室成員的幫助有很大的關(guān)系，每一個(gè)微小的步驟都有可能把人卡得生不如死，希望能順順利利，感恩。

2019/09/03