前期記錄
先確定目標基因
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（1）
然后對目的基因進行背景調(diào)查
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（2）磨刀不誤砍柴工
設計sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA設計好之后
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（3）sgRNA及引物設計
CRISPR/Cas9基因敲除實驗全記錄（4）構(gòu)建sgRNA+Cas9載體
golden gate構(gòu)建好載體，酶切驗證成功
293FT細胞轉(zhuǎn)染驗證
（1）sgRNA+pSpCas9載體用lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染至293FT細胞（按照轉(zhuǎn)染試劑的說明書走），確保轉(zhuǎn)染效率> 70%；
（2）72 h后收集細胞提取基因組DNA（按照基因組DNA提取試劑盒的說明書操作）；
（3）使用事先設計好的引物進行PCR擴增，這里使用的酶是NEB公司的Q5 high-fidelity Polymerase，一切按照該酶的說明書嚴格操作；
（4）將目的條帶切割下來并使用膠回收試劑盒回收DNA條帶，一切按照膠回收試劑盒說明書進行操作；
（5）回收后的DNA樣本，經(jīng)T7 Endonuclease I 酶解驗證錯配DNA，部分結(jié)果如下：
驗證成功，開始正式實驗
時間飛逝，上次說提取質(zhì)粒后驗證，這部分就花了一天時間；加上打臺風影響細胞復蘇，耽誤了1-2天，復蘇細胞后隔一天立刻傳代種板，第二天發(fā)現(xiàn)細胞稍微少了一點，又等了一天，轉(zhuǎn)染后雖然是72h應該收sample，但細胞數(shù)目略少，可能提取不到足夠的基因組DNA，所以讓細胞又長了一天，直到百分之80以上的融合度（因為我用的是24孔板）。基因組DNA提取之后立刻進行Q5PCR，跑膠切膠回收，T7EI酶切再跑膠，這個騷操作一天做不完，分了兩天做，所以就一下子花了將近十天時間，嚶嚶嚶，這要放在其他組，可能都要被老板罵死了。
為啥不提前準備好細胞，為啥不計數(shù)種板，為啥為啥為啥為啥，事實上我自己也覺得不滿意，但好在最終得到了想要的結(jié)果，在還不確定自己的操作是否足夠風騷的時候，請務必要小心謹慎，畢竟每一步都有可能出問題。我在新手期曾遇到過的問題如下：
轉(zhuǎn)染效率沒達到百分之70，最后找到原因是因為轉(zhuǎn)染試劑過期，加大量之后就搞定了；
基因組DNA提取效率低，僅僅有幾到十幾ng/μL，質(zhì)量也很差。這里需要注意的是，293FT細胞非常脆弱，一方面要保證足夠的細胞量，另外一方面，由于該細胞貼壁不牢，可直接吹下收集去裂解，而不需要使用胰酶消化下來，再終止離心收集去裂解提取基因組DNA。
-
Q5 PCR可能會出現(xiàn)問題，一般情況下Q5PCR是很穩(wěn)妥的實驗，但是前天我有一套sample全部都沒有出條帶，一時半會不能找到原因在哪里，這種時候我會將引物丟棄，重新配置PCR體系，保留原條件的同時，增加extension time，結(jié)果令人滿意，不僅是原條件，新條件都出現(xiàn)了目的條帶。說明我可能是在配樣的過程中出現(xiàn)了問題。因此還是建議樣本量大的時候還是要盡量耐心去check每一個步驟或者直接分開操作。
image.png Q5PCR說了，在不加錯樣的情況下，一般是沒有難度的，但一般膠回收可能會出現(xiàn)問題，同樣是濃度低。那么需要注意的就是，瓊脂糖凝膠盡量配厚一點，不要讓樣本從上樣孔里面溢出來，一點點都不能浪費，那么操作膠回收實驗的時候也要盡量保證不浪費，盡可能保留多一些DNA fragment，但最好的解決辦法就是在Q5PCR步驟時要獲取足夠多的PCR產(chǎn)物。
