1. Author
金奇，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究員，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院長聘教授，國家杰出青年基金獲得者，國家級(jí)高層次人才項(xiàng)目獲得者，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)術(shù)咨詢委員會(huì)學(xué)部委員。先后畢業(yè)于北京醫(yī)學(xué)院（獲得醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位）、中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院（獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位），并在美國國立衛(wèi)生研究院和美國聯(lián)邦疾病預(yù)防與控制中心從事博士后研究。擔(dān)任過病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、衛(wèi)健委病原系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院結(jié)核病研究中心主任等；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所所長、中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所副所長；國家“863計(jì)劃”基因操作與蛋白質(zhì)工程技術(shù)主題專家組組長、國家“973計(jì)劃”傳染病專題專家組組長、國家重大傳染病防治重大科技專項(xiàng)結(jié)核病領(lǐng)域?qū)＜医M組長及中國疾病預(yù)防控制中心首席專家；中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分會(huì)主任委員和中國防癆協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)分會(huì)主任委員等。
2. Background
2.1 流感病毒病毒學(xué)特征
甲型流感病毒（InfluenzaA virus）是正黏病毒科（Orthomyxoviridae）的重要病原體，其病毒學(xué)特征復(fù)雜且具有高度變異性。以下是其主要病毒學(xué)特征：
1. 病毒結(jié)構(gòu)
基因組：單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組由8個(gè)節(jié)段組成（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS），每個(gè)節(jié)段編碼不同蛋白。分節(jié)段的特點(diǎn)使病毒易通過基因重配（Reassortment）產(chǎn)生新亞型。
病毒顆粒：多形性（球形或絲狀），直徑約80-120 nm。核心為核糖核蛋白復(fù)合體（RNP），外包脂質(zhì)雙層膜（來自宿主細(xì)胞）。
表面蛋白：血凝素（HA）：介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞唾液酸受體結(jié)合，促進(jìn)膜融合。神經(jīng)氨酸酶（NA）：水解唾液酸，幫助病毒從細(xì)胞釋放。HA和NA是主要抗原，也是亞型分類的依據(jù)（如H1N1、H3N2等）。
2. 抗原特性
抗原漂移（Antigenic Drift）：HA或NA的點(diǎn)突變積累導(dǎo)致小幅度變異，引起季節(jié)性流行。
抗原轉(zhuǎn)變（Antigenic Shift）：不同亞型病毒在宿主內(nèi)發(fā)生基因節(jié)段重配，產(chǎn)生全新HA/NA組合（如H1→H5），可能導(dǎo)致大流行。
3. 宿主范圍與傳播
自然宿主：野生水禽（如鴨、雁）是主要儲(chǔ)存宿主。跨種傳播：可感染家禽、豬、馬、海豹等，偶爾感染人類（如H5N1、H7N9）。傳播途徑：飛沫、氣溶膠、接觸污染物。
4. 復(fù)制周期
吸附與侵入：HA結(jié)合宿主細(xì)胞唾液酸受體（α-2,3或α-2,6鏈接，決定宿主特異性）。內(nèi)吞與融合：通過內(nèi)體酸化觸發(fā)HA構(gòu)象變化，釋放病毒RNA至細(xì)胞質(zhì)。基因組復(fù)制：病毒RNA在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄/復(fù)制，依賴病毒RNA聚合酶（易出錯(cuò)，導(dǎo)致高突變率）。裝配與釋放：新病毒顆粒在細(xì)胞膜出芽，NA協(xié)助釋放。
5. 變異與進(jìn)化
高突變率：RNA聚合酶缺乏校對(duì)功能，導(dǎo)致高頻點(diǎn)突變。人獸共患潛力：豬作為“混合器”，可同時(shí)感染人/禽流感病毒，促進(jìn)重配（如2009年H1N1大流行株）。
6. 實(shí)驗(yàn)室檢測
PCR：檢測病毒RNA（金標(biāo)準(zhǔn)）。抗原檢測：快速試紙（靈敏度較低）。病毒培養(yǎng)：MDCK細(xì)胞或雞胚分離病毒。血清學(xué)：檢測抗體滴度（如HI試驗(yàn)）。
3. Methods
1. 噬菌體庫的建立
2.?ELISA
3. HA與NA的蛋白表達(dá)
4. 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
5. IgG1的表達(dá)純化
6.?血凝實(shí)驗(yàn)
7. 中和實(shí)驗(yàn)
8. 定點(diǎn)突變
9. 動(dòng)物預(yù)防與保護(hù)實(shí)驗(yàn)
4. Results
實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)以感染了H7N9的康復(fù)患者的外周血為樣本，構(gòu)建了噬菌體展示庫。在這個(gè)庫中，包括了1.2 E8-1.7 E8個(gè)克隆。經(jīng)過三輪淘洗之后確定得到18個(gè)克隆——6個(gè)來自于VH3家族，12個(gè)來自VH4家族。作者將其分為4組，組1：VH3+VL1；組2：VH4+VL1；組3：VH3+VL3；組4：VH4+VL1。在ELISA實(shí)驗(yàn)中，第1組的mAb表現(xiàn)出NA結(jié)合活性；第3組mAb能夠與人類和鳥類H7 HA相互作用； 第4組mab識(shí)別人類H7 HA，但沒有鳥類H7。 為了進(jìn)一步表征18個(gè)mAb的結(jié)合特異性，在293T細(xì)胞中表達(dá)了病毒HA和NA蛋白。 使用免疫熒光測定（IFA）測試了這些蛋白與mAb的結(jié)合親和力。 結(jié)果與使用ELISA檢測獲得的結(jié)果一致。
第4組mAB在細(xì)胞上表現(xiàn)出對(duì)H7N9病毒的明顯中和活性。 但是，對(duì)于3組抗體，很少檢測到中和活性。對(duì)于第1組或第2組抗體，沒有發(fā)現(xiàn)可檢測到的中和活性。在第4組中，兩個(gè)Fab表現(xiàn)出更強(qiáng)的中和活性，并轉(zhuǎn)化為名為HNIgGA6（H7N9Fab12）和HNIgGA6B5（H7N9Fab17）的全長IgG1分子，以進(jìn)行進(jìn)一步研究。兩個(gè)mAb都表現(xiàn)出強(qiáng)大的HI活動(dòng)。? HNIgGA6的HI滴度低至0.8 mg/ml，而HNIgGA6B5為1.6 mg/ml。 然后在細(xì)胞上確定它們針對(duì)活的H7N9病毒的中和活性。
人類H7 HA和Avian H7 HA之間有七個(gè)氨基酸差別。構(gòu)建了人類H7 HA的七個(gè)突變體，每次將七個(gè)氨基酸之一的一種變?yōu)轼B類H7 HA中的相應(yīng)氨基酸。檢測所有突變體發(fā)現(xiàn)只有V186G或L226Q消除了結(jié)合活性。 為了進(jìn)一步確認(rèn)這些發(fā)現(xiàn)，禽類H7 HA在同一位置被反向突變。 這些構(gòu)建體也在細(xì)胞中表達(dá)，并通過IFA檢測。如預(yù)期的那樣，僅當(dāng)突變G186V和Q226L都引入禽類H7
HA時(shí)，結(jié)合活性中的逆轉(zhuǎn)。此外還可以通過梯度稀釋后抗體壓力篩選突變株，發(fā)現(xiàn)5代以后能夠穩(wěn)定存活的突變株普遍攜帶V186G和L226Q突變。在后續(xù)的小鼠保護(hù)與預(yù)防實(shí)驗(yàn)中顯示，劑量為20mg/kg時(shí)，能夠起到很好的保護(hù)作用。
5. Discussion
作者：Zhe Chen
通訊作者：Qi Jin
單位：MOH Key Laboratory of SystemsBiology of Pathogens, Institute of Pathogen Biology, Chinese Academy of MedicalSciences and Peking Union Medical College, Beijing, China.
年份：2015.03.30
期刊：Nature communications
科學(xué)問題 ：H7N9康復(fù)者體內(nèi)是否存在強(qiáng)效中和抗體？
討論：由于感染的嚴(yán)重程度，H7N9流感A型流感病毒亞型引起了嚴(yán)重的全球健康問題，并且由于人類的死亡率約為25％。 到2014年9月，總共有454例H7N9病例報(bào)道了171例死亡。迫切需要一種有效的針對(duì)H7N9感染的抗病毒療法據(jù)我們所知，據(jù)報(bào)道與H7反應(yīng)的唯一中和抗體是CR8020，它對(duì)大多數(shù)Group2流感病毒存在中和活性。不幸的是，CR8020對(duì)最近的H7N9病毒中和能力低。 在這項(xiàng)研究中從H7N9感染中康復(fù)者的血液中篩選了該中和抗體。 兩種抗體在體外和體內(nèi)能夠中和H7N9病毒。
HA是相同亞基的三聚體，每個(gè)亞基都包含兩個(gè)由單個(gè)前體的蛋白水解裂解產(chǎn)生的多肽。每個(gè)HA單體都包含其球形頭部的RB，該RB負(fù)責(zé)病毒受體識(shí)別和相互作用，幾種保守的氨基酸（98y，153W，153W，183h和195y），以及其邊緣的三個(gè)保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)。一般來說，禽病毒更喜歡在a-2,3鏈中與半乳糖結(jié)合唾液酸，而人類病毒更喜歡結(jié)合a-2,6連接的唾液酸。 除了其在受體結(jié)合中的作用外，HA還通過誘導(dǎo)通過其莖區(qū)域誘導(dǎo)膜融合進(jìn)入細(xì)胞。使用IFA檢測，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)已鑒定的抗體都與病毒HA蛋白相互作用，但與NA不相互作用。 進(jìn)一步的分析表明，RBS基序?qū)τ谥泻涂贵w與HA的結(jié)合至關(guān)重要。RBS V186G或L226Q中的兩個(gè)氨基酸殘基取代中的兩個(gè)導(dǎo)致人H7 HA結(jié)合能力的喪失。它通過RBS與HA蛋白結(jié)合并通過RBS與HA蛋白結(jié)合，并與其識(shí)別并與人類細(xì)胞受體的識(shí)別并互動(dòng)。先前報(bào)告：識(shí)別球形頭部的中和抗體表現(xiàn)出強(qiáng)大的HI活性，而中和抗體的中和抗體通常不會(huì)表現(xiàn)出這種活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這些發(fā)現(xiàn)是一致的，因?yàn)镠NIgGA6和HNIgGA6B5都表現(xiàn)出有效的HI活動(dòng)。總之，中和抗體的表征為186V和226L在病毒 - 受體相互作用中的基本作用提供了進(jìn)一步的支持。此外，這些結(jié)果為開發(fā)新型中和抗體提供了見識(shí)。 與球形頭部反應(yīng)的抗體相比，與與流感病毒的莖區(qū)結(jié)合的抗體，病毒中和所需的中和抗體濃度通常要低得多。186V和226升的基本作用限制了它們的變化和隨之而來的抗原漂移，
小鼠模型中評(píng)估了HNIgGA6和HNIgGA6B5的抗病毒作用。 用1-10mgkg的HNIGGB5預(yù)防1-10mgkg 1賦予小鼠免受H7N9感染的100％保護(hù)，而HNIgGA6賦予了較低的保護(hù)水平。如體重恢復(fù)所示，感染小鼠的健康也得到了顯著改善。
在11例測試的患者中，有2例在N9中賦予對(duì)oseltamivir和Zanamivir的耐藥性的R292K突變。在測試過程中還檢測到R152K突變。 該突變?cè)隗w外表現(xiàn)出對(duì)Zanamivir和Oseltamivir的輕度抗性。中和抗體，例如直接在殘基186V和226L處攻擊HA蛋白的HNIGGA6和HNIGGB5提供了另一種H7N9治療。 即使可能逃脫，與其他已建立的療法一起使用以減少病毒逃生或抗性的前景時(shí)，被動(dòng)免疫也可能非常有效。
