今日之森
人生就像是激起的一朵浪花，轉(zhuǎn)瞬即逝，卻也希望飛舞的日子里既能經(jīng)歷人性的可愛，也能經(jīng)歷物性的神奇。
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公眾號
通常來說，真核生物的基因，這里主要指的是植物gene的克隆，常以cDNA為模板進(jìn)行克隆。這就有個問題，很多同學(xué)想要的基因嘗試克隆了N多次都拿不到，這就很惱火，連基因都拿不到，還搞什么？
問題的關(guān)鍵應(yīng)該首先考慮cDNA。
只要cDNA沒有問題，那理論上肯定可以克隆到想要的基因。這就不得不考慮RNA的質(zhì)量以及反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量。只有謹(jǐn)慎操作，從源頭避免問題，才能在后續(xù)實(shí)驗中規(guī)避掉盡可能多的意外bug
RNA提取的注意事項
RNA的質(zhì)量幾乎決定了后續(xù)實(shí)驗的成敗。常見的挑戰(zhàn)有：RNA降解、低純度、低產(chǎn)率及DNA污染等。1?采樣后立即穩(wěn)定RNA
RNA不穩(wěn)定，極易降解。許多樣品含有高水平的RNase，會快速降解RNA。
為保證RNA最大程度的穩(wěn)定，應(yīng)在采樣后立即置于液氮，并盡快提取RNA。2 確保樣品充分溶解
這是提高RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的重要一環(huán)。3 消除DNA污染注意：目前RNA的提取已十分便捷，只需按照試劑盒操作步驟嚴(yán)格執(zhí)行，基本上不會出現(xiàn)大的問題。
反轉(zhuǎn)錄原理
（中）此外，針對真核生物mRNA的反轉(zhuǎn)錄，還可采用基因特異性引物，僅擴(kuò)增需要的cDNA。該引物在后續(xù)還可以作為PCR的反向引物。（下）隨機(jī)引物。
檢查RNA的完整性
RNA的質(zhì)量直接影響了cDNA的質(zhì)量。而不用時間節(jié)點(diǎn)采樣，提取的RNA質(zhì)量也會有差異，因此有必要在RNA提取后檢查RNA的質(zhì)量及完整性。通常完整的真核生物RNA包括28S和18SRNA條帶，兩條帶的亮度應(yīng)差不多。基因的克隆
即使十分小心的提取了RNA，又十分謹(jǐn)慎的進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄拿到了cDNA，有時還是無法得到自己想要的DNA，一遍一遍又一遍……
這時或許可以從以下幾個方便考慮：
1 使用多個不同批次的cDNA模板分別克??；
2 將多個批次的cDNA模板混勻后進(jìn)行克隆；
3 如果以上兩種方法均未果，可針對目的基因設(shè)計基因特異性引物，獲取目基因cDNA后再克隆（小概率事件，但我覺得有必要嘗試。因為真核生物mRNA幾乎無一例外都有多（A）尾巴）；
4 如果以上三種方法都未果，那就有可能是個假基因，或許有必要從基因本身的結(jié)構(gòu)考慮。
“但愿每次回憶，對生活的都不感到負(fù)疚。”
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