總體原理與準(zhǔn)備
- 目的：將 MYC-tagged CASP5A-BioID2 或 CASP5C-BioID2 融合構(gòu)建體穩(wěn)定整合到人類結(jié)腸類器官細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)持久表達(dá)，用于后續(xù)鄰近標(biāo)記（proximity labeling）、質(zhì)譜鑒定互作蛋白（如 DVL）等。
- 載體：通常使用第三代慢病毒載體（lentiviral vector，如 pLenti、pLVX 等），含啟動(dòng)子（EF1α 或 CMV）、目的基因、選擇標(biāo)記（puromycin resistance 等）和包裝信號(hào)。
- 類器官狀態(tài)：使用人類結(jié)腸活檢來源的類器官（human colonic organoids），在 Matrigel 中以 3D 生長(zhǎng)，培養(yǎng)基含 Wnt 激動(dòng)劑（如 R-spondin1、Noggin、EGF 等，WENR 條件）以維持干性。
轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟
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慢病毒生產(chǎn)（Virus Production）：
- 在包裝細(xì)胞（如 HEK293T 或 Lenti-X 293T）中共轉(zhuǎn)染慢病毒載體 + 包裝質(zhì)粒（psPAX2、pMD2.G 等）。
- 收集病毒上清，濃縮（超速離心或試劑盒），滴度測(cè)定（通常 107–109 TU/mL）。
- 過濾（0.45 μm）去除細(xì)胞碎片。
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類器官準(zhǔn)備（Organoid Dissociation）：
- 挑選生長(zhǎng)良好的類器官（通常培養(yǎng) 3–7 天后）。
- 用 TrypLE Express 或 Dispase/Collagenase 酶消化 Matrigel 和類器官，制成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液（避免完全單細(xì)胞以提高存活率）。
- 過濾（40–70 μm 濾網(wǎng)），計(jì)數(shù)細(xì)胞，離心重懸于培養(yǎng)基 + Rock 抑制劑（Y-27632，防止 anoikis）。
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轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）：
- 將細(xì)胞團(tuán)/單細(xì)胞與濃縮慢病毒（MOI 通常 5–50，根據(jù)滴度優(yōu)化）混合。
- 添加 Polybrene（4–8 μg/mL）或類似助轉(zhuǎn)染劑，促進(jìn)病毒附著。
- 離心感染（spinfection）：低速離心（300–800 g，30–60 min，32°C）增強(qiáng)病毒進(jìn)入。
- 或靜置孵育（37°C，4–24 h），期間可輕搖。
- 對(duì)于 3D 類器官，有時(shí)直接將完整類器官碎片與病毒共孵育（但效率較低，通常先消化）。
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洗滌與重鋪（Recovery and Embedding）：
- 離心去除病毒，PBS 洗 1–2 次。
- 重懸于 Matrigel，滴入培養(yǎng)板（50–100 μL/滴），37°C 聚合 10–20 min。
- 加入含 Rock 抑制劑的完全類器官培養(yǎng)基，恢復(fù)培養(yǎng) 1–3 天。
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篩選與擴(kuò)增（Selection and Expansion）：
- 加入 puromycin（或其他抗生素，根據(jù)載體）篩選穩(wěn)定整合細(xì)胞（濃度 0.5–2 μg/mL，逐步摸索，避免毒性）。
- 篩選后擴(kuò)增類器官，驗(yàn)證表達(dá)（Western blot 檢測(cè) MYC-tag 或 CASP5，免疫熒光確認(rèn)定位）。
- 對(duì)于 BioID2 實(shí)驗(yàn)，后續(xù)添加外源生物素（通常 50 μM，數(shù)小時(shí)至 overnight）觸發(fā)鄰近標(biāo)記。
注意事項(xiàng)
- 效率挑戰(zhàn)：腸道類器官轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常低于 2D 細(xì)胞系，需優(yōu)化 MOI、消化程度和 Rock 抑制劑使用。論文中成功用于 BioID，說明效率足夠支持質(zhì)譜鑒定。
- 對(duì)照：空載體、催化死突變體（CASP5C C/A 等）、未加生物素對(duì)照。
文章中的protocol
將 3D 培養(yǎng)的結(jié)腸和小腸類器官用 TrypLE（Thermo Fisher, 12605028）消化成較大的細(xì)胞團(tuán)塊，隨后在超低吸附 24 孔板（Corning, 3473）中，與慢病毒上清和擴(kuò)增培養(yǎng)基（expansion medium，補(bǔ)充 10 mM Y-27632）1:1 混合液共同孵育 4 小時(shí)。然后收集類器官，重新置于補(bǔ)充有 10 mM Y-27632 的擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行 3D 培養(yǎng)。若需要，在 3D 培養(yǎng)第 2 天加入抗生素進(jìn)行篩選。
