火起來的“相分離”是什么？

Nature|doi:10.1038/d41586-018-03070-2

相分離或者說相變（Phase separation，Phase Transition）是目前比較火的一個(gè)研究領(lǐng)域，已有的研究表明相分離在細(xì)胞中普遍存在，與基因組的組裝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能密切相關(guān)，相分離的失調(diào)可能是一些疾?。ㄈ缟窠?jīng)/肌肉退行性疾?。┌l(fā)生的病因，相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)家也開始通過相分離這個(gè)視角重新審視相關(guān)疾病，通過干擾異?！跋喾蛛x”來達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。
雖然最近經(jīng)常聽到“相分離”相關(guān)研究的討論，但是對(duì)這個(gè)概念和它的應(yīng)用依然很抽象。所以打算通過幾篇文獻(xiàn)簡要了解下相分離的相關(guān)知識(shí)，主要從以下幾方面總結(jié)：

  • 相分離的概念
  • 發(fā)展歷史、發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢
  • 應(yīng)用
  • 相關(guān)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)開展的難點(diǎn)是什么
  • 對(duì)我們目前的研究有什么啟示
  • 相關(guān)研究者

1. 相分離是什么？

相分離或者相變（Phase separation）描述的是一種細(xì)胞里不同成分間相互碰撞、融合形成液滴，從而使一些成分被包裹在液滴內(nèi)，一些成分被阻隔在液滴外的現(xiàn)象，類似于水油相混，或者可以想象成下雨天傘上的雨滴逐漸滴落的過程。這種現(xiàn)象在液體之間是常見的，但是，2009年，Brangwynne和Hyman關(guān)于線蟲P顆粒的研究，發(fā)現(xiàn)P顆粒（一種蛋白質(zhì)）并非像我們通常認(rèn)為的是一種固體，而是像液滴一樣，相互碰撞融合，劇烈搖晃后會(huì)分散成很小的液滴，而后又很快地融合形成大液滴。之后科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的許多無膜細(xì)胞器——核仁、Cajal bodies、stress granules、miRISC，及突觸的細(xì)胞骨架——都是特定的蛋白質(zhì)/RNA的相變。

細(xì)胞內(nèi)的相分離：
人們認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)成分能夠通過“相分離”的方式相互分開，實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)功能?！跋喾蛛x”一旦發(fā)生異常，就可能造成疾病。

  • 蛋白質(zhì)或RNA分子間的物理作用力可以使他們相互分開或聚集。一旦分子達(dá)到一定濃度，他們就會(huì)發(fā)生相分離，相似的成分聚集在一起加速生物學(xué)反應(yīng)（有點(diǎn)類似于相似相容），或者隔離無關(guān)的分子。
  • 細(xì)胞膜上的信號(hào)傳遞
    在神經(jīng)細(xì)胞中，細(xì)胞間的信號(hào)傳遞時(shí)蛋白質(zhì)能夠在連接處的聚集和相分離是保證細(xì)胞間信號(hào)傳遞正常進(jìn)行所必需的。
  • DNA折疊包裝
    在細(xì)胞核中，相分離幫助壓縮折疊不使用的DNA并抑制其活性。一些可能與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白被阻隔在外。
  • 液滴成為障礙
    在肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥中，分離成液滴的蛋白質(zhì)會(huì)逐漸凝結(jié)，變硬，形成有害的固體物質(zhì)。
細(xì)胞內(nèi)的“相分離”

2. 發(fā)展歷史、現(xiàn)狀和趨勢

從2009年以后，“相分離”的研究開始出現(xiàn)。2011年，Hyman, Mitchison 和 Brangwynne發(fā)現(xiàn)核仁也有這種液滴現(xiàn)象。一年后，德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)院的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家 Michael Rosen 和生物化學(xué)家Steven McKnight在實(shí)驗(yàn)的試管中發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)分子間存在較弱的作用力，彼此相互靠近，形成液滴類的物質(zhì)。他們的研究與之前Brangwynne 和Hyman’s 的工作不同的是證明了相分離可以在試管中通過簡單的生化反應(yīng)重現(xiàn)。真正的研究熱潮大概是從2015年初，加拿大多倫多兒童醫(yī)院的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Julie Forman-Kay團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，一種可能影響精子功能的蛋白質(zhì)在人體細(xì)胞內(nèi)形成液滴。2015年底，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物蛋白質(zhì)存在相分離現(xiàn)象。

2018年的現(xiàn)狀
不完全統(tǒng)計(jì)（需要補(bǔ)充），2018年CNS上已發(fā)表十幾篇文章。

  • 其中3月份Nature上發(fā)表了一篇文章介紹了相分離領(lǐng)域的發(fā)展歷史和研究進(jìn)展（https://www.nature.com/articles/d41586-018-03070-2）。
  • 4月份，Cell上一次性發(fā)表了4篇文章還有一篇評(píng)論文章，介紹了對(duì)稱或非對(duì)稱精氨酸二甲基化做為翻譯后修飾和核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白做為分子伴侶抑制FUS蛋白等RNA結(jié)合蛋白（RBP）的相關(guān)的“相變”（FUS全稱為Fused in sarcoma，是一種漸動(dòng)人癥ALS中關(guān)鍵致病蛋白，也是一種RNA結(jié)合蛋白）。

DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.056
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.003
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.002
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.004

  • 6月份，Cell上發(fā)表了一篇綜述，詳細(xì)地介紹了相分離的概念，在無膜器官的形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、超分子組裝等生物過程中扮演的功能。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.02.004

  • 7月份Sience上發(fā)表了3篇文章和1篇評(píng)論介紹了相分離與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

DOI: http://dx.doi.org/10.1126/science.aar3958
DOI: http://dx.doi.org/10.1126/science.aar2555
DOI: 10.1126/science.aar4199
DOI: 10.1126/science.aau4795

  • 12月份Cell上又發(fā)表了一篇文章介紹了轉(zhuǎn)錄因子通過液-液相分離激活基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)其功能。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.042

3. 應(yīng)用

隨著相分離的研究逐漸增多，研究人員發(fā)現(xiàn)相分離在無膜器官的形成 ，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、超分子組裝、基因的激活等扮演著功能，相分離異?？赡軐?dǎo)致疾病，如神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、衰老等。

  • 神經(jīng)退行性疾病
    相分離與神經(jīng)退行性疾病聯(lián)系起來的研究還是較多的，如：
    • 在肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）（一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾?。┲杏^察到“相分離” ，發(fā)現(xiàn)FUS蛋白和hnRNPA1在ALS中形成液滴，液滴粘性逐漸變強(qiáng)，最終形成纖維狀的固體，在ALS中異常沉積。
    • 阿爾茨海默病患者腦內(nèi)異常沉積的tau蛋白也存在“相分離”，“相分離”可能是tau蛋白聚集的初始觸發(fā)因素。
  • 腫瘤
    相分離的異?？赡艽龠M(jìn)某些癌癥的發(fā)生。如分子病理學(xué)家Miguel Rivera和他的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種與尤文氏肉瘤有關(guān)的蛋白。這種蛋白聚集在與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因組附近時(shí)可以激活致癌基因表達(dá)，而異常的“相分離”就可能促使這種蛋白在這些區(qū)域附近聚集。(DOI:10.1016/j.cell.2017.07.036).
  • 保護(hù)作用
    除了對(duì)細(xì)胞的損傷作用，相分離還具有保護(hù)作用。Hyman和Alberti發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞在低pH的壓力環(huán)境下一些重要蛋白會(huì)聚集成液滴啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制。當(dāng)pH回升后，這些液滴會(huì)分散開，細(xì)胞恢復(fù)正常的功能。
  • 基因組失活
    在人體細(xì)胞中，形成液滴更多的是一種組裝策略。加州大學(xué)舊金山分校生物化學(xué)家Geeta Narlikar和她的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，“相分離”幫助封存人體部分基因組，這些基因組永久不會(huì)被激活，主要發(fā)揮結(jié)構(gòu)性作用（X染色體失活不知道是否和相分離相關(guān)）。
  • 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    2018年Science和Cell上發(fā)表的幾篇文章都是和基因調(diào)控相關(guān)。
    • （1）轉(zhuǎn)錄因子的低復(fù)雜度區(qū)域間的相互作用調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄

原文：Imaging dynamic and selective low-complexitydomain interactions that control gene transcription
發(fā)表雜志：Chong et al., Science 361, 378 (2018)
發(fā)表日期：27 July 2018
DOI/html： http://dx.doi.org/10.1126/science.aar2555

許多真核生物的轉(zhuǎn)錄因子包含天然的、無序的、低復(fù)雜序列區(qū)域（ low-complexity sequence domains ，LCDs），但是這些LCD如何驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄激活還不清楚。這篇文章中研究者用活細(xì)胞單分子成像技術(shù)揭示了TF LCDs在外源性和內(nèi)源性的基因組位點(diǎn)形成高度集中的相互作用中心。TF LCD hubs固定DNA的結(jié)合，招募RNA Pol II, 激活轉(zhuǎn)錄。hubs內(nèi)LCD-LCD間的相互作用是高度動(dòng)態(tài)的、并且選擇性的結(jié)合輔因子，對(duì)己二酮的破壞敏感性也不同。在生理?xiàng)l件下，快速可逆的LCD-LCD相互作用發(fā)生在TF和RNA Pol II之間，沒有檢測到相分離。他們的發(fā)現(xiàn)可能揭示了轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一種基本機(jī)制，同時(shí)也體現(xiàn)出了單分子成像技術(shù)在開發(fā)與疾病相關(guān)的基因調(diào)控相互作用的靶向藥物中具有廣闊的應(yīng)用前景。
用到的技術(shù)和方法：

  • 活細(xì)胞單分子成像技術(shù)
  • synthetic LacO (Lac operator) arrays合成乳糖操縱序列和內(nèi)源GGAA微衛(wèi)星基因座
  • CRISPR-Cas9基因編輯，誘變、基因激活、細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以及各種高分辨率成像方法，包括熒光相關(guān)光譜、光漂白后的熒光恢復(fù)、晶格光片顯微鏡、三維DNA熒光原位雜交和活細(xì)胞單粒子跟蹤。

從這些用到的技術(shù)中可以推測普通的實(shí)驗(yàn)室如果要開展這樣的研究，可能需要有各種高分辨率的成像技術(shù)。

From hubs to phase separation: Activation occurs in a wide range of TFconcentrations
  • （2）超級(jí)增強(qiáng)子通過相分離調(diào)控基因表達(dá)

原文：Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control
發(fā)表雜志：Sabari et al., Science 361, 379 (2018)
發(fā)表日期：27 July 2018
DOI/html： http://dx.doi.org/10.1126/science.aar3958

超級(jí)增強(qiáng)子（super-enhancer，SE）是由連續(xù)排列的增強(qiáng)子串聯(lián)形成的增強(qiáng)子簇，決定細(xì)胞特性和功能的大多數(shù)關(guān)鍵基因附近通常伴隨著出現(xiàn)超級(jí)增強(qiáng)子。這篇文章表明轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4和MED1可以在超級(jí)增強(qiáng)子處發(fā)生相分離形成液滴，將轉(zhuǎn)錄機(jī)器聚集在超級(jí)增強(qiáng)子附近，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄過程的區(qū)室化反應(yīng)，其中內(nèi)在無序區(qū)域（intrinsically disordered regions，IDRs）在相分離過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這項(xiàng)研究為超級(jí)增強(qiáng)子通過相分離調(diào)控基因表達(dá)的模型提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定和疾病發(fā)生過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控過程提供了全新的視角和概念。


Phase separation of coactivators compartmentalizes and concentrates the transcription apparatus
  • （3） 轉(zhuǎn)錄因子在活化區(qū)域通過相分離激活基因表達(dá)調(diào)控

原文：Transcription Factors Activate Genes through the Phase-Separation Capacity of Their Activation Domains.
發(fā)表雜志：Cell 175, 1842–1855
發(fā)表日期：December 13, 2018
DOI/html: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.042

這篇文章報(bào)道了轉(zhuǎn)錄因子OCT4和GCN4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域通過與轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物Mediator發(fā)生液-液相分離激活基因表達(dá)，這項(xiàng)研究為我們進(jìn)一步理解數(shù)百種其它的轉(zhuǎn)錄因子的功能機(jī)理，以及發(fā)育和疾病過程中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新思路。


Transcription factors (TFs) form phase-separated condensates with Mediator

  • 重塑染色質(zhì)結(jié)構(gòu)
    11月29日，Cell雜志在線發(fā)表了Cliff Brangwynne課題組利用CasDrop體系的最新研究成果Liquid Nuclear Condensates Mechanically Sense and Restructure the Genome（DOI：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.057）。該研究表明，細(xì)胞核內(nèi)的“液-液相分離”現(xiàn)象能夠感知并重塑染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。

  • 藥物
    目前已經(jīng)有通過相分離的手段治療疾病的公司成立。如加州大學(xué)的細(xì)胞生物學(xué)家Ron Vale在今年年初成立了一家公司，主要通過破壞與神經(jīng)退行性疾?。ㄈ邕\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、亨廷頓舞蹈病等）相關(guān)的RNA液滴進(jìn)行藥物研發(fā)。
    另外一個(gè)相分離研究的研究者Taylor也打算成立一個(gè)公司，將使用一個(gè)他們研發(fā)的工具“光顆粒（Optogranule）”識(shí)別藥物靶點(diǎn)，這個(gè)工具能夠再現(xiàn)細(xì)胞中“相分離”相關(guān)病理表現(xiàn)和過程。這項(xiàng)技術(shù)可以使研究者在幾小時(shí)內(nèi)觀察到培養(yǎng)皿里神經(jīng)退行性變化的過程。

相關(guān)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)開展有什么難點(diǎn)？

相分離相關(guān)的技術(shù)有成像技術(shù)，首先必須有方法可以觀察到這種相分離的過程；二是如何調(diào)控從而影響相分離過程的技術(shù)。
2017年，Brangwynne團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)光控系統(tǒng)（OptoDroplets），通過改變光的劑量，調(diào)控活細(xì)胞內(nèi)不同液體成分的聚集程度，使液滴出現(xiàn)或消失。


OptoDroplets

2018年，Brangwynne團(tuán)隊(duì)又設(shè)計(jì)了CasDrop系統(tǒng)，可以定量、定位地研究多種蛋白的相分離現(xiàn)象。


CasDrop

相關(guān)研究者

參考資料

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