過去十年，靶向DNA序列變異的治療方法取得了顯著進(jìn)展，癌癥醫(yī)學(xué)也因此受益匪淺。然而，純粹基于基因的治療選擇方法存在局限性，因為同一基因型可以衍生出多種不同的細(xì)胞狀態(tài)。在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞狀態(tài)異質(zhì)性是由表觀遺傳過程驅(qū)動的，這些過程調(diào)控著轉(zhuǎn)錄等基于DNA的功能；而這些過程的紊亂是癌癥的標(biāo)志性特征，并導(dǎo)致缺陷細(xì)胞狀態(tài)的出現(xiàn)。單細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步使我們能夠量化腫瘤的表觀基因組異質(zhì)性并理解其機(jī)制，從而徹底改變了我們對表觀基因組變化如何驅(qū)動癌癥演化的認(rèn)識。本綜述探討了表觀基因組異質(zhì)性和可塑性作為細(xì)胞狀態(tài)庫，進(jìn)而成為腫瘤演化來源的觀點。文中討論了量化表觀基因組異質(zhì)性的最佳實踐，并探討了其各種成因和后果，包括表觀基因組重編程、隨機(jī)變化和持久記憶。本文還探討了限制表觀基因組異質(zhì)性的新治療方法的設(shè)計，其長期目標(biāo)是限制癌癥的發(fā)生和發(fā)展。（Published online: 16 October 2024）
癌癥發(fā)展軌跡涵蓋了一個連續(xù)譜，從癌前細(xì)胞及其周圍基質(zhì)啟動腫瘤發(fā)生開始，最終演變?yōu)榫哂袧撛谇忠u性、轉(zhuǎn)移性和/或耐藥性的表型。數(shù)十年的基因組學(xué)研究揭示了遺傳變異（單核苷酸多態(tài)性或體細(xì)胞突變）在腫瘤演變中的關(guān)鍵作用。然而，與正常的發(fā)育過程類似，越來越多的證據(jù)表明，非遺傳變異在驅(qū)動癌癥相關(guān)表型變化方面也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，這種作用獨(dú)立于遺傳改變，無論是在癌癥發(fā)生初期還是在腫瘤演變過程中。這些非遺傳變異中包括染色質(zhì)變異，指的是基因組中區(qū)分癌細(xì)胞狀態(tài)的位點，其特征在于由于表觀基因組標(biāo)記的丟失或獲得而導(dǎo)致的染色質(zhì)狀態(tài)改變。這些表觀基因組標(biāo)記包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、組蛋白變體和核小體定位（圖1）。
表觀基因組標(biāo)記的精確調(diào)控對于基因表達(dá)的調(diào)控和細(xì)胞身份的維持都至關(guān)重要。因此，這些標(biāo)記的破壞是癌癥的普遍特征。事實上，非遺傳變異可以啟動腫瘤的形成。例如，在小鼠中，通過表觀遺傳沉默CDKN2A并激活PDGFRA，可以誘發(fā)異檸檬酸脫氫酶(IDH) 突變型膠質(zhì)瘤。PDGFRA基因的激活是通過破壞CTCF的絕緣體功能介導(dǎo)的，而CTCF絕緣體功能的破壞是通過其結(jié)合位點的甲基化實現(xiàn)的。類似地，染色質(zhì)因子（表觀基因組標(biāo)記的讀取器、寫入器或擦除器）的擾動可以促進(jìn)腫瘤的形成；例如，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNMT1) 功能低下的小鼠存在整體DNA低甲基化，并最終發(fā)展為侵襲性淋巴瘤。在果蠅中，即使是polyhomeotic（一種多梳蛋白）的短暫丟失也足以轉(zhuǎn)化細(xì)胞，這凸顯了染色質(zhì)變體在癌癥發(fā)生中的重要性。此外，在TET2功能缺失突變的淋巴瘤中，恢復(fù)完整的染色質(zhì)因子可以阻斷癌癥進(jìn)展，這表明TET2失活在癌癥發(fā)生中起著因果作用。除了這些功能性證據(jù)外，在大多數(shù)癌癥中，正是由于缺乏已知的遺傳驅(qū)動因素，才使得人們開始關(guān)注非遺傳變異在腫瘤發(fā)生中的潛在作用。例如，后顱窩A型兒童室管膜瘤缺乏復(fù)發(fā)性遺傳變異，但表現(xiàn)出DNA高甲基化，并且對基于DNMT抑制劑的表觀遺傳療法特別敏感，這表明表觀基因組機(jī)制是其發(fā)生的唯一原因。
同樣，僅憑基因突變無法完全解釋原發(fā)性疾病向轉(zhuǎn)移性疾病的進(jìn)展。在高級別漿液性卵巢癌中，對多個轉(zhuǎn)移灶的分析表明，轉(zhuǎn)移性疾病是多克隆的，并且一部分亞克隆沒有特有的基因突變。在胰腺導(dǎo)管腺癌中，盡管對超過26個不同的轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行了測序，但尚未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶特異性的驅(qū)動突變。相反，另一項研究發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移灶特異性的染色質(zhì)變異，其特征是組蛋白H3第9位賴氨酸的二甲基化或三甲基化（H3K9me2或H3K9me3）的缺失，而原發(fā)腫瘤則沒有這些變異。來自對功能性染色質(zhì)變異的直接觀察以及來自基因驅(qū)動突變?nèi)笔У拈g接證據(jù)的累積表明，非遺傳變異是癌癥發(fā)生和發(fā)展不可或缺的組成部分。與基因變異不同，染色質(zhì)變異在一定程度上是不穩(wěn)定的，這為通過靶向驅(qū)動癌細(xì)胞狀態(tài)的非基因變異來預(yù)防或治療癌癥提供了獨(dú)特的干預(yù)機(jī)會。因此，開發(fā)描述表觀基因組變異的方法學(xué)和概念工具對于理解這種變異的產(chǎn)生方式及其如何驅(qū)動腫瘤進(jìn)化過程至關(guān)重要。
在本綜述中，我們使用“表觀基因組異質(zhì)性”一詞來描述癌前組織或腫瘤中表型不同的細(xì)胞狀態(tài)共存的現(xiàn)象，每種狀態(tài)都具有一組獨(dú)特的染色質(zhì)變異。我們探討了表觀基因組異質(zhì)性和可塑性反映了細(xì)胞狀態(tài)庫的擴(kuò)大，這些細(xì)胞狀態(tài)可以通過表觀基因組重編程、隨機(jī)變異的選擇或持久記憶來驅(qū)動腫瘤的演化。我們討論了腫瘤演化過程中表觀基因組變異的動態(tài)變化及其在腫瘤表型演化中的作用。我們還探討了如何通過更深入地理解腫瘤獲得和利用表觀基因組異質(zhì)性的方式（無論是通過染色質(zhì)變異的穩(wěn)定傳遞還是隨機(jī)過程），來指導(dǎo)設(shè)計針對表觀遺傳過程的有效預(yù)防或治療方法。
癌癥中的單細(xì)胞表觀基因組學(xué)
本綜述是對先前關(guān)于單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)的深入綜述的補(bǔ)充，描述了已用于研究患者或癌癥模型中腫瘤演化表觀基因組基礎(chǔ)的技術(shù)（補(bǔ)充表1）。許多此類單細(xì)胞技術(shù)最初是為研究正常組織的發(fā)育和異質(zhì)性而設(shè)計的；迄今為止，只有轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序的單細(xì)胞分析（scATAC?seq）被廣泛應(yīng)用于癌癥研究（表1）。單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)在癌癥研究中應(yīng)用有限，部分原因是采樣方面的挑戰(zhàn)（框2）。然而，一些技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)開始揭示癌癥中的表觀基因組異質(zhì)性。
框 2 | 采樣挑戰(zhàn) ?
單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)在癌癥研究中的應(yīng)用有限，部分原因是采樣方面的挑戰(zhàn)，包括需要包含大量細(xì)胞的生物樣本，以及與單細(xì)胞或單核分辨率兼容的保存方法。大多數(shù)單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)需要包含數(shù)十萬個細(xì)胞的新鮮或冷凍樣本，而可用于研究的生物樣本庫中的腫瘤樣本通常是福爾馬林固定、石蠟包埋的標(biāo)本，僅包含幾千個細(xì)胞。盡管單細(xì)胞方法已成功應(yīng)用于冷凍組織，但這些方法通常僅限于一兩種表觀基因組測量模式。要以單細(xì)胞分辨率全面表征腫瘤表觀基因組，需要一系列表觀基因組檢測方法，包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色質(zhì)構(gòu)象或核小體位置。就此而言，癌癥的單細(xì)胞表觀基因組學(xué)仍處于起步階段（見下圖）。這些技術(shù)的開發(fā)與其首次應(yīng)用于癌細(xì)胞之間存在著明顯的間隔。 ?
理解表觀基因組異質(zhì)性在腫瘤演化中的作用，得益于時間序列（time-series）測量，可以比較疾病進(jìn)展的各個階段，或研究對抗癌治療的反應(yīng)。然而，由于從臨床環(huán)境中獲取縱向樣本極其困難，因此，采用這種方法完成的研究寥寥無幾。對疾病各階段表觀基因組異質(zhì)性的研究比較了同一患者體內(nèi)共存的不同疾病階段的樣本，例如原發(fā)腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，或與同步癌前病變共存的腫瘤。此外，世界各地已出現(xiàn)快速尸檢項目，用于從近期去世的個體體內(nèi)多個轉(zhuǎn)移部位采集腫瘤樣本，有時還會采集匹配的生物樣本庫原發(fā)腫瘤樣本。 ?
為了最大限度地減少侵入性連續(xù)腫瘤取樣的使用，表觀基因組學(xué)檢測方法已進(jìn)行改進(jìn)，以使用可非侵入性采集的樣本，例如血液或尿液。出于倫理和操作方面的考慮，在癌癥模型中也更容易獲得時間序列樣本。癌細(xì)胞系在表觀基因組學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用（表1）。基于患者來源的類器官、患者來源的異種移植模型和基因工程小鼠模型的先進(jìn)癌癥模型可以模擬腫瘤發(fā)生不同階段的腫瘤及其微環(huán)境的復(fù)雜性。對單一模型中收集的縱向樣本進(jìn)行研究，也有助于控制與遺傳多態(tài)性相關(guān)的表觀基因組變異。
癌細(xì)胞狀態(tài)的決定因素
表觀基因組特征在定義癌細(xì)胞的各種狀態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)的重大進(jìn)展（框1）使得對癌癥各個階段的表觀基因組異質(zhì)性進(jìn)行詳細(xì)探索成為可能。
癌前狀態(tài)的表觀基因組特征。結(jié)直腸癌中遺傳變異的順序獲得是癌前細(xì)胞向癌細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的一個典型模型。通過整合來自息肉、腫瘤和鄰近正常結(jié)腸黏膜同步樣本的單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和單核ATAC測序（snATAC-seq）數(shù)據(jù)，我們得以重建結(jié)腸癌形成早期階段的完整圖譜，涵蓋了已分化細(xì)胞和干細(xì)胞樣細(xì)胞狀態(tài)。本研究展示了如何利用染色質(zhì)變異追蹤癌癥起始過程中的細(xì)胞群體動態(tài)，通過對結(jié)直腸癌患者結(jié)腸內(nèi)共存的不同階段的癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞進(jìn)行采樣，鑒定了與癌癥進(jìn)展相關(guān)的染色質(zhì)變異和異?；虮磉_(dá)模式。該方法揭示了染色質(zhì)變異與癌前階段細(xì)胞群體向干細(xì)胞樣狀態(tài)的轉(zhuǎn)變相關(guān)(Becker W. R.et al.,Nat. Genet, 2022)。類似地，對巴雷特食管患者的單細(xì)胞ATAC測序（scATAC-seq）研究表明，腸化生區(qū)域由混合的癌前細(xì)胞狀態(tài)組成，并且癌前細(xì)胞在通常僅限于胃或腸組織的增強(qiáng)子處表現(xiàn)出染色質(zhì)可及性（圖2a）。在小鼠胰腺癌發(fā)展過程中，一項針對正常、炎癥、癌前和腫瘤組織的單細(xì)胞表觀基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)變異，這些變異能夠啟動癌前上皮，并最初導(dǎo)致多種Kras突變細(xì)胞狀態(tài)的出現(xiàn)，特別是通過擴(kuò)展細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)。
腫瘤內(nèi)表觀基因組多樣性。許多研究致力于描述已建立腫瘤的表觀基因組異質(zhì)性。例如，在膠質(zhì)瘤中，scATAC-seq通過識別與每種細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的候選轉(zhuǎn)錄因子，在理解同一腫瘤內(nèi)共存的各種癌細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控基礎(chǔ)方面發(fā)揮了重要作用。這些不同的表觀遺傳定義的細(xì)胞狀態(tài)表現(xiàn)出獨(dú)特的功能特性，并對腫瘤演化產(chǎn)生不同的影響。例如，F(xiàn)OXD1驅(qū)動的侵襲性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞狀態(tài)的存在是與生存率低相關(guān)的不良預(yù)后因素。在婦科癌癥中，scATAC-seq揭示了以染色質(zhì)變異為特征的癌細(xì)胞狀態(tài)，這些變異定義了不同的調(diào)控元件，從而影響參與標(biāo)志性癌癥通路基因的表達(dá)。一項針對11種不同癌癥類型的225多個腫瘤樣本的單細(xì)胞ATAC測序研究，鑒定出了泛癌和癌癥類型特異性的調(diào)控單元以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，這些調(diào)控單元和轉(zhuǎn)錄因子是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動因素。在另一項研究中，飛行時間流式細(xì)胞術(shù)（cytometry by time-of-flight, CyTOF）分析在兒童膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的表觀基因組異質(zhì)性，其中兩種共存的腫瘤細(xì)胞表觀基因組亞群可以通過組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3）或乙?；℉3K27ac）水平的差異來區(qū)分。
單細(xì)胞DNA甲基化數(shù)據(jù)使得在循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumour cell, CTC）群體中識別罕見的個體癌細(xì)胞狀態(tài)成為可能。類似地，對肺腺癌的單細(xì)胞DNA甲基化譜分析揭示了表皮生長因子受體（EGFR）突變癌細(xì)胞中一組獨(dú)特的染色質(zhì)變異，并將這種基因變異與患者來源癌癥樣本中表觀基因組異質(zhì)性的出現(xiàn)聯(lián)系起來。將來自同一細(xì)胞或細(xì)胞群的單細(xì)胞DNA甲基化數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)整合，已被用于測量膠質(zhì)瘤中的表觀基因組隨機(jī)性（圖2b）。DNA甲基化的隨機(jī)變化也可能使細(xì)胞能夠應(yīng)對壓力條件，包括接受抗癌治療。此外，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中CTCF結(jié)合位點DNA甲基化的隨機(jī)變化可能作為轉(zhuǎn)錄變異的基礎(chǔ)，并可能促進(jìn)克隆選擇。
癌癥治療反應(yīng)。治療反應(yīng)和耐藥性與表觀基因組異質(zhì)性相關(guān)，包括染色質(zhì)可及性、組蛋白修飾和DNA修飾的變異。例如，對基底細(xì)胞癌連續(xù)活檢樣本進(jìn)行snATAC-seq分析，已鑒定出免疫治療后T細(xì)胞耗竭的潛在表觀基因組驅(qū)動因素。類似地，在多發(fā)性骨髓瘤中，一項縱向snATAC-seq和RNA-seq研究表明，針對G蛋白偶聯(lián)受體C家族5成員D（GPRC5D）的治療耐藥性可能歸因于使GPRC5D基因座失活的獲得性染色質(zhì)變異。對配對的治療前和治療后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本進(jìn)行snATAC-seq分析發(fā)現(xiàn)，治療后樣本中由AP-1轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動的間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)富集。
此外，對匹配的未經(jīng)治療和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤之間H3K27me3圖譜的演變進(jìn)行分析，能夠識別出反映腫瘤內(nèi)表觀基因組異質(zhì)性的癌細(xì)胞狀態(tài)連續(xù)譜。利用單細(xì)胞染色質(zhì)免疫沉淀測序（scChIP-seq）分析管腔型乳腺癌和三陰性乳腺癌的患者來源異種移植模型中H3K27me3的表達(dá)，揭示了這些腫瘤中啟動子區(qū)域這種抑制性組蛋白修飾富集的異質(zhì)性。特別是，未經(jīng)治療的腫瘤中預(yù)先存在的細(xì)胞群與治療耐藥細(xì)胞具有相似的表觀基因組特征（局部H3K27me3富集缺失）（圖2c）。這些細(xì)胞在接受癌癥治療后可能會產(chǎn)生耐藥細(xì)胞群，盡管還需要進(jìn)一步的治療誘導(dǎo)染色質(zhì)改變才能達(dá)到完全耐藥。對三陰性乳腺癌體外模型進(jìn)行額外的單細(xì)胞H3K27me3譜分析，進(jìn)一步繪制了癌細(xì)胞在多個時間點接受治療后的表觀基因組演變圖譜，并揭示了耐藥持續(xù)細(xì)胞（drug-tolerant persister cells, DTP細(xì)胞，即癌癥治療的最初幸存者）所共有的特定抑制性表觀基因組。
監(jiān)測表觀基因組腫瘤演化
了解表觀基因組異質(zhì)性在腫瘤演化中的作用，得益于時間序列或多位點單細(xì)胞表觀基因組測量（圖3a），這使得我們能夠比較疾病的連續(xù)階段并識別對抗癌治療的反應(yīng)。然而，在臨床環(huán)境中獲取同一患者的多個樣本面臨著巨大的挑戰(zhàn)（框2），目前只有少數(shù)研究采用了這種方法。本節(jié)將描述多重采樣的挑戰(zhàn)，并探討如何利用單個表觀基因組快照來重建表觀基因組演化過程。
表觀克隆動態(tài)的推斷。除了樣本可用性之外，縱向和多區(qū)域采樣研究的整合也帶來了計算方面的挑戰(zhàn)。越來越多的分析方法正在被設(shè)計出來以應(yīng)對這些挑戰(zhàn)。除下文提到的少數(shù)例外情況外，大多數(shù)用于從單細(xì)胞數(shù)據(jù)推斷細(xì)胞軌跡的計算方法主要是為scRNA-seq開發(fā)的，需要進(jìn)行調(diào)整以應(yīng)對單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)帶來的獨(dú)特挑戰(zhàn)。單細(xì)胞表觀基因組測量本質(zhì)上是稀疏的，每個細(xì)胞的中位讀取數(shù)比scRNA-seq低50-100倍。這種情況的出現(xiàn)是因為基因組位點的總潛在信號從根本上受到DNA分子拷貝數(shù)的限制，這導(dǎo)致二倍體基因組中每個DNA元件的讀取數(shù)為零、一或二。此外，還必須確定用于單細(xì)胞表觀基因組分析中特征計數(shù)的相關(guān)信息離散化單元。例如，研究人員可以使用功能分割方法（例如基于基因的啟動子或增強(qiáng)子注釋），或者采用更通用的方法（例如滑動窗口或固定大小的區(qū)間）。
一種計算方法是將縱向研究視為時間序列，其中“實時”信息用于指導(dǎo)模型并預(yù)測細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。例如，Waddington最優(yōu)傳輸模型利用這種方法從基因工程小鼠肺癌縱向樣本中分離出一簇具有高度可塑性的過渡細(xì)胞。分析預(yù)測這些細(xì)胞將產(chǎn)生多種其他癌細(xì)胞狀態(tài)，從而導(dǎo)致腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。另一種方法是通過將觀察到的但未經(jīng)監(jiān)督的變異（例如表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)的變化，或給定狀態(tài)細(xì)胞比例的變化）與腫瘤演化階段相關(guān)聯(lián)，從而在沒有預(yù)先了解時間線的情況下重建細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。來自縱向和多區(qū)域樣本的單細(xì)胞表觀基因組數(shù)據(jù)的積累也可以受益于人工智能方法的進(jìn)步。這些方法已經(jīng)能夠從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中區(qū)分細(xì)胞狀態(tài)并構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，現(xiàn)在也開始預(yù)測基因擾動的影響。基于人工智能的方法還可以通過識別單細(xì)胞表觀基因組數(shù)據(jù)中的復(fù)雜模式來促進(jìn)腫瘤演化的建模。
基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)預(yù)測細(xì)胞分化潛能。在缺乏從多個時間或空間樣本中收集的數(shù)據(jù)的情況下，可以使用替代計算方法，根據(jù)單細(xì)胞表觀基因組數(shù)據(jù)預(yù)測細(xì)胞分化潛能（圖3b，前瞻性重建）。例如，可以基于染色質(zhì)狀態(tài)方差和細(xì)胞內(nèi)熵來量化細(xì)胞內(nèi)表觀基因組變異或“噪聲”，從而評估細(xì)胞向特定分化路徑的定向性（圖3c）。當(dāng)應(yīng)用于白血病細(xì)胞樣本中獲得的DNA甲基化數(shù)據(jù)時，該方法揭示了相鄰CpG位點甲基化水平的隨機(jī)不一致性，研究人員將其稱為局部無序甲基化區(qū)域，這一特征與不良臨床結(jié)果相關(guān)。由于染色質(zhì)狀態(tài)的相互依賴性，這種方法可以應(yīng)用于其他單細(xì)胞表觀基因組學(xué)檢測數(shù)據(jù)類型，例如檢測相鄰核小體上大規(guī)模組蛋白修飾的一致性，并有助于區(qū)分低效和高效癌細(xì)胞群。
與提供每個細(xì)胞評分的細(xì)胞內(nèi)表觀基因組噪聲測量方法互補(bǔ)的是，測量細(xì)胞間變異性旨在捕捉細(xì)胞群體內(nèi)的表觀基因組異質(zhì)性（圖3d）。為此，可以使用多種指標(biāo)，包括成對細(xì)胞間相關(guān)性和香農(nóng)熵。例如，一項針對去勢抵抗性前列腺癌的scRNA-seq研究比較了幾種正交方法來量化從管腔表型向基底表型轉(zhuǎn)變的細(xì)胞簇中的細(xì)胞間變異性。該分析揭示了在此轉(zhuǎn)變過程中細(xì)胞間變異性的瞬時增加。研究人員使用創(chuàng)新的單細(xì)胞測量方法（例如細(xì)胞類型概率熵）以及細(xì)胞類型基因特征評分來量化非遺傳治療耐藥性出現(xiàn)過程中譜系保真度的喪失增加。然而，將這些指標(biāo)應(yīng)用于單細(xì)胞表觀基因組學(xué)數(shù)據(jù)仍有待檢驗，并且需要進(jìn)行功能性實驗來驗證預(yù)測的效力評分。
基于多模態(tài)信息的細(xì)胞潛能模型。多組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為通過評估染色質(zhì)變異和細(xì)胞狀態(tài)，在單一數(shù)據(jù)集中測量細(xì)胞潛能提供了新的契機(jī)。例如，匹配的scRNA-seq和scATAC-seq研究已被用于量化特定表觀基因組產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄輸出的能力，這可作為早期胰腺腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞潛能的指標(biāo)（圖3e）。創(chuàng)新的實驗方法現(xiàn)在能夠以單細(xì)胞分辨率進(jìn)行多種表觀基因組測量，從而從單個表觀基因組快照預(yù)測腫瘤的演變（圖3e）。例如，一種能夠對異染色質(zhì)（通過標(biāo)記富含H3K9me3的區(qū)域）和常染色質(zhì)（通過標(biāo)記可及染色質(zhì)區(qū)域，如scATAC-seq）進(jìn)行單細(xì)胞分析的雙重檢測方法已被提出，用于測量染色質(zhì)速度，而染色質(zhì)速度是細(xì)胞潛能的一個相關(guān)指標(biāo)。這種方法源于這樣的邏輯：相反的表觀基因組修飾的比例（量化表觀基因組的一致性和不一致性）可以作為細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)（類似于利用外顯子和內(nèi)含子序列的比例，通過單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)預(yù)測細(xì)胞未來狀態(tài)）。這種雙重檢測方法能夠預(yù)測腫瘤演化的軌跡，例如，在耐藥性發(fā)展過程中，染色質(zhì)變異體的動態(tài)獲取情況。多標(biāo)記單細(xì)胞染色質(zhì)檢測技術(shù)以及捕獲多種DNA甲基化形式的其他方法的進(jìn)步，為開發(fā)結(jié)合多種表觀基因組修飾的指標(biāo)來預(yù)測細(xì)胞增殖能力提供了更多機(jī)會。
譜系追蹤結(jié)合單細(xì)胞表觀基因組學(xué)。將單細(xì)胞表觀基因組學(xué)檢測與系統(tǒng)發(fā)育重建相結(jié)合，是另一種從單個表觀基因組快照模擬腫瘤演化的有效方法（圖3b，回顧性重建）。系統(tǒng)發(fā)育重建可以通過追蹤內(nèi)在遺傳變化或利用外源譜系報告基因來實現(xiàn)。將表觀基因組學(xué)分析與內(nèi)在譜系重建相結(jié)合的初步研究已展示了該方法的技術(shù)可行性。例如，從DNA甲基化變化推斷出的譜系樹與白血病中通過遺傳譜系追蹤獲得的譜系樹相吻合。另一種方法是將scATAC-seq數(shù)據(jù)與線粒體DNA突變檢測相結(jié)合，以識別與特定染色質(zhì)變異相關(guān)的腫瘤亞克隆，這表明在白血病患者體內(nèi)存在易于產(chǎn)生耐藥性的細(xì)胞。將通過分子條形碼進(jìn)行外源譜系評估并整合到單細(xì)胞表觀基因組學(xué)分析中，為研究腫瘤演化過程中的表觀基因組變異提供了一種很有前景的技術(shù)，盡管目前應(yīng)用此方法的研究還很有限。例如，在三陰性乳腺癌中，前瞻性慢病毒條形碼方法結(jié)合snATAC-seq和RNA-seq技術(shù)，揭示了與腫瘤起始和化療耐受性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序和染色質(zhì)變異模塊。我們預(yù)期，未來幾年將有大量研究整合從多種表觀基因組學(xué)分析中獲得的關(guān)于時間表觀基因組變異的數(shù)據(jù)，以了解腫瘤演化的基礎(chǔ)。一個值得關(guān)注的可能發(fā)展方向是將空間組學(xué)技術(shù)與譜系條形碼技術(shù)相結(jié)合，這可以補(bǔ)充空間表觀基因組學(xué)（例如空間CUT&Tag）的進(jìn)展。
單細(xì)胞表觀基因組學(xué)面臨的挑戰(zhàn)
當(dāng)前局限性。目前的單細(xì)胞表觀基因組學(xué)方法存在兩個主要局限性。首先，覆蓋范圍有限，因為染色質(zhì)變異通常在核小體水平上進(jìn)行測量，而核小體水平僅跨越數(shù)百個堿基對（相比之下，在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，每個基因的累積信號可以跨越數(shù)千個堿基對的串聯(lián)序列）。其次，單個細(xì)胞中的信號放大效果不佳，因為在二倍體基因組中，信號只能從一到兩個等位基因中檢測到；而在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，可以通過擴(kuò)增單個細(xì)胞的全長RNA來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本的檢測，從而實現(xiàn)每個細(xì)胞近乎完整的轉(zhuǎn)錄組測序。
為了繞過單細(xì)胞表觀基因組數(shù)據(jù)固有的擴(kuò)增和覆蓋率問題，目前已采用三種方法。第一種方法稱為偽混合（pseudo-bulking），即將多個相似的單細(xì)胞譜圖聚合起來，從而能夠從原本稀疏的數(shù)據(jù)集中推斷染色質(zhì)變異的獲取情況。第二種方法是將千堿基（kilobases）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域的信號串聯(lián)起來，這涉及合并來自功能相關(guān)DNA序列（例如大型異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域）的信號，以提高每個細(xì)胞的覆蓋率。最后，對純化細(xì)胞群進(jìn)行批量分析（bulk profiling）有助于確定稀有細(xì)胞亞型的特征，這些特征可用于挖掘單細(xì)胞表觀基因組數(shù)據(jù)，并揭示偽混合策略可能遺漏的功能性細(xì)胞群。深入了解表觀基因組異質(zhì)性需要對患者樣本進(jìn)行大規(guī)模表征，并分析大量的單細(xì)胞。最終，技術(shù)創(chuàng)新對于實現(xiàn)每個細(xì)胞近乎完整的表觀基因組測序至關(guān)重要，它能夠提高每個細(xì)胞中多種表觀基因組修飾（無論是單獨(dú)還是組合）的信息讀取數(shù)。
新興的單細(xì)胞表觀基因組學(xué)方法。一系列新興的空間和多模態(tài)單細(xì)胞表觀基因組學(xué)方法，為我們理解表觀基因組異質(zhì)性帶來了新的維度，并即將被應(yīng)用于癌癥研究。空間scATAC-seq已應(yīng)用于乳腺癌研究，其基于條形碼的固相捕獲。類似地，總組蛋白修飾的空間定量分析揭示了乳腺腫瘤中組蛋白修飾富集的模式。能夠直接在組織中實現(xiàn)染色質(zhì)可及性或組蛋白修飾空間分辨率的原位標(biāo)記方法，正為探索癌癥中的空間表觀基因組異質(zhì)性鋪平道路。盡管已在癌細(xì)胞系中開展了單細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)象分析（scHi-C）的概念驗證研究，但由于數(shù)據(jù)集覆蓋率低，目前該技術(shù)在患者來源的腫瘤樣本中的應(yīng)用仍受到限制。
多模態(tài)表觀基因組學(xué)方法，即在同一細(xì)胞中同時測量多種表觀基因組模式，有望通過組合信息（表觀基因組編碼的固有屬性）加深我們對癌癥表觀基因組失調(diào)的理解。例如，單細(xì)胞核小體占用率和甲基化組測序（scNOMe-seq）以及基于轉(zhuǎn)座酶的單細(xì)胞基因組和表觀基因組測序（scGET-seq）已被應(yīng)用于癌細(xì)胞系，以同時探測DNA甲基化和染色質(zhì)可及性，或常染色質(zhì)和異染色質(zhì)。此類多模態(tài)表觀基因組學(xué)單細(xì)胞技術(shù)的整合，以及用于研究代謝物或蛋白質(zhì)水平的互補(bǔ)單細(xì)胞技術(shù)的開發(fā)，有望增進(jìn)我們對癌癥表觀基因組學(xué)的理解。
表觀基因組異質(zhì)性的起源
多種機(jī)制可導(dǎo)致細(xì)胞中染色質(zhì)變異的出現(xiàn)。某些變異會導(dǎo)致細(xì)胞缺陷狀態(tài)（Defective cell states），而一部分表觀基因組異質(zhì)性在生理條件下可被細(xì)胞容忍。
遺傳和表觀遺傳變異
遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)在癌癥進(jìn)化中存在著明顯的聯(lián)系，因為編碼染色質(zhì)因子和組蛋白變體的基因是所有癌癥類型中最常見的突變基因之一。例如，組蛋白變體H3.3的錯義突變導(dǎo)致賴氨酸27被甲硫氨酸取代，這種突變在許多兒童腦癌中均有發(fā)現(xiàn)，并已被確定為改變癌細(xì)胞表觀遺傳狀態(tài)的機(jī)制之一。腫瘤內(nèi)所有細(xì)胞共有的染色質(zhì)因子突變可能在癌癥發(fā)展早期就已獲得，例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的IDH1突變或透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中的PBRM1（編碼SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物成員）突變。相反，染色質(zhì)因子基因（例如SETD2，編碼組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2）的突變可能在腫瘤演化的后期階段出現(xiàn)，此時這些突變更可能特異性地存在于特定亞克隆中。大約10-20%的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌存在SETD2突變。TRACERx（Tracking Cancer Evolution Through Therapy，通過治療追蹤癌癥演化）研究組的研究也報道了類似的染色質(zhì)因子基因亞克隆突變。
編碼染色質(zhì)因子或組氨酸變體的基因突變可導(dǎo)致染色質(zhì)變體的積累，并顯著增加癌細(xì)胞的表觀基因組異質(zhì)性。例如，在白血病中，染色體易位導(dǎo)致KMT2A賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶與其他染色質(zhì)調(diào)控蛋白融合，從而在基因啟動子處產(chǎn)生異常的二價染色質(zhì)狀態(tài)，這些啟動子同時被H3K4me3和H3K27me3標(biāo)記，而非僅被其中一種標(biāo)記。這些二價位點在同一患者的細(xì)胞中表現(xiàn)出高度的表觀基因組變異性。與之相反，染色質(zhì)因子的突變也可能降低表觀基因組異質(zhì)性。例如，EZH2的激活突變會導(dǎo)致先前處于二價狀態(tài)的啟動子徹底沉默，從而阻斷正常的B細(xì)胞分化。
在非小細(xì)胞肺癌和黑色素瘤模型中進(jìn)行的基因敲除篩選表明，癌細(xì)胞對環(huán)境壓力的適應(yīng)可以通過染色質(zhì)因子的失活來介導(dǎo)，特別是那些由泛癌突變研究中被歸類為癌癥驅(qū)動基因的基因編碼的因子。例如，多梳抑制復(fù)合物2（PRC2）蛋白或染色質(zhì)重塑因子SMARCD1的失活會增加癌細(xì)胞對營養(yǎng)匱乏的耐受性，這表明表觀基因組調(diào)控的破壞會阻礙癌細(xì)胞對壓力的促凋亡和抗增殖反應(yīng)。
此外，在腫瘤演化過程中，基因變異和染色質(zhì)變異的獲得之間存在明顯的相互影響。染色質(zhì)可及性的改變會影響結(jié)直腸癌中DNA突變的積累。反過來，全基因組加倍會觸發(fā)染色質(zhì)的構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致致癌染色質(zhì)變異的形成?；蜃儺惡腿旧|(zhì)變異也可以在腫瘤演化的統(tǒng)一過程中趨同，發(fā)揮相似的致癌功能。這些發(fā)現(xiàn)表明，基因變異和染色質(zhì)變異同步出現(xiàn)以支持腫瘤演化，這強(qiáng)調(diào)了理解它們之間功能關(guān)系的重要性。
代謝和環(huán)境波動
腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種環(huán)境信號密切相關(guān)，包括癌細(xì)胞為促進(jìn)自身生長而對能量、生物質(zhì)（biomass）生產(chǎn)和氧化損傷解毒的需求增加所導(dǎo)致的代謝波動。這些代謝波動會生成染色質(zhì)變異體并增加表觀基因組異質(zhì)性，因為許多細(xì)胞代謝物是染色質(zhì)因子的輔助因子或底物。例如，通用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸水平的降低會干擾組蛋白和DNA的甲基化，從而影響癌細(xì)胞的甲基化。
缺氧條件也能誘導(dǎo)染色質(zhì)變異：例如，表觀遺傳修飾酶Fe(II)/2-氧戊二酸加氧酶需要克雷布斯循環(huán)中間體2-氧戊二酸（由IDH1-IDH3產(chǎn)生）以及氧氣和Fe(II)來催化氧化表觀基因組修飾，例如羥基化和去甲基化。在缺氧條件下，諸如ten-eleven?translocation (TET) 和含Jumonji C結(jié)構(gòu)域的組蛋白賴氨酸去甲基化酶 (KDM) 等酶家族受到抑制。缺氧通過抑制賴氨酸特異性去甲基化酶KDM5A和KDM6A來誘導(dǎo)組蛋白賴氨酸高甲基化。此外，缺氧通過限制TET酶活性來阻止DNA去甲基化，這模擬了IDH突變癌癥中染色質(zhì)變異的獲得。缺氧也被認(rèn)為有利于驅(qū)動兒童后顱窩A型室管膜瘤的染色質(zhì)變異的形成。
此外，癌癥進(jìn)展過程中獲得的染色質(zhì)變異體依賴于代謝適應(yīng)。例如，胰腺癌轉(zhuǎn)移灶由于染色質(zhì)修飾的大規(guī)模重編程，與原發(fā)腫瘤相比，表現(xiàn)出更高的葡萄糖依賴性。除了代謝波動外，環(huán)境暴露于香煙煙霧也會誘導(dǎo)染色質(zhì)變異體的形成，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展：組蛋白抑制性修飾的初始丟失之后，會出現(xiàn)異常的DNA甲基化模式。類似地，炎癥也與DNA甲基化模式的改變有關(guān)，這已在結(jié)腸炎誘導(dǎo)結(jié)腸癌的小鼠模型中得到證實。在這些小鼠中，炎癥相關(guān)的DNA高甲基化導(dǎo)致對胃腸道穩(wěn)態(tài)和損傷反應(yīng)至關(guān)重要的基因沉默?？偠灾?，環(huán)境波動和代謝變化會導(dǎo)致細(xì)胞中染色質(zhì)變異體的積累，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)化過程。
隨機(jī)表觀基因組變異
隨機(jī)表觀基因組變異（Stochastic?epigenomic variation）是指細(xì)胞表觀基因組隨時間推移發(fā)生的隨機(jī)生物學(xué)變化的積累，這些變化可能被細(xì)胞耐受，也可能導(dǎo)致細(xì)胞功能改變。隨機(jī)表觀基因組變異還可以促進(jìn)表觀克隆（epi-clones）的形成。與由突變或環(huán)境因素驅(qū)動的定向表觀基因組變化不同，隨機(jī)表觀基因組變異是細(xì)胞內(nèi)在過程自發(fā)產(chǎn)生的。
然而，隨機(jī)表觀基因組變異背后的機(jī)制尚不完全清楚。盡管DNA復(fù)制是一個受到嚴(yán)格調(diào)控的過程，但如果復(fù)制偶聯(lián)的組蛋白沉積或新復(fù)制的DNA鏈中DNA甲基化標(biāo)記的復(fù)制過程中出現(xiàn)缺陷，則DNA復(fù)制仍存在獲得隨機(jī)染色質(zhì)變異的風(fēng)險。復(fù)制時間的差異會加劇這些風(fēng)險，并且在不對稱細(xì)胞分裂和對稱細(xì)胞分裂中可能受到不同的影響。此外，當(dāng)染色體分離錯誤或在微核形成和破裂的不同階段，也會出現(xiàn)隨機(jī)表觀基因組變異，這兩種情況都為染色質(zhì)變異的產(chǎn)生創(chuàng)造了條件，而這些變異會對基因表達(dá)產(chǎn)生長期影響。復(fù)制非依賴性染色質(zhì)組裝的不準(zhǔn)確性，例如轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生的不準(zhǔn)確性，也是獲得隨機(jī)表觀基因組變異的潛在途徑。DNA修復(fù)過程與隨機(jī)表觀基因組變異密切相關(guān)，因為它涉及損傷修復(fù)前后的染色質(zhì)重塑。例如，人為誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂被認(rèn)為會引發(fā)“表觀遺傳漂移(epigenetic drift)”，其特征是染色質(zhì)變異體隨年齡增長而積累。盡管關(guān)于隨機(jī)表觀基因組變異的起源仍有很多未知之處，但癌癥的發(fā)生和發(fā)展越來越多地與那些既非由基因突變也非由環(huán)境信號引起的染色質(zhì)變異體聯(lián)系起來。
表觀基因組對腫瘤演化的控制
受其他研究者的啟發(fā)，表觀基因組異質(zhì)性對腫瘤細(xì)胞進(jìn)化潛能的貢獻(xiàn)可以可視化為能量圖，該圖強(qiáng)調(diào)了表觀基因組機(jī)制在控制細(xì)胞狀態(tài)能量平衡和轉(zhuǎn)變潛能方面的作用（圖4）。理解每個能量谷（由其深度、寬度和與其他能量谷的高度差定義）對細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的具體限制，對于設(shè)計有效的抗癌療法至關(guān)重要，這些療法旨在解決影響腫瘤進(jìn)化的動態(tài)表觀遺傳過程。例如，如果腫瘤進(jìn)化依賴于一群已啟動的癌細(xì)胞的擴(kuò)增，那么針對該特定細(xì)胞群的靶向療法可以根除癌癥。然而，由于癌細(xì)胞的內(nèi)在補(bǔ)充能力，同樣的療法對于阻止部分癌細(xì)胞的適應(yīng)性變化則無效。
表觀基因組隨機(jī)性增加
表觀基因組異質(zhì)性會擴(kuò)大癌細(xì)胞的吸引盆地（basin?of attraction，所有細(xì)胞都可以達(dá)到的初始細(xì)胞狀態(tài)集合）（圖4a），從而導(dǎo)致出現(xiàn)許多具有亞穩(wěn)態(tài)基因表達(dá)程序的變異細(xì)胞狀態(tài)。連續(xù)的吸引盆地代表不同的亞穩(wěn)態(tài)細(xì)胞群庫，這些細(xì)胞群可能包括具有腫瘤起始能力的細(xì)胞（腫瘤前細(xì)胞）或已準(zhǔn)備好耐受藥物治療的細(xì)胞（耐藥前細(xì)胞）。在腫瘤前肺癌細(xì)胞、腫瘤起始期的結(jié)直腸癌細(xì)胞以及治療耐受性發(fā)展過程中，均觀察到腫瘤和癌前細(xì)胞樣本中非遺傳細(xì)胞間變異性的增加。在這些異質(zhì)性細(xì)胞狀態(tài)中，一些可能具有適應(yīng)性優(yōu)勢，并在特定應(yīng)激因素（例如炎癥或藥物治療）下被選擇。在白血病模型中，轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的增加一直是適應(yīng)性最強(qiáng)克隆的特征?；虮磉_(dá)的變異性也可以作為腫瘤演化的驅(qū)動因素。例如，在尤文氏肉瘤中，致癌性EWS-ETS融合轉(zhuǎn)錄因子（如EWSR1-FLI1）活性水平的波動導(dǎo)致癌細(xì)胞在增殖和遷移狀態(tài)之間振蕩。這種振蕩在轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移灶生長之間的轉(zhuǎn)變中起著至關(guān)重要的作用。
將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，或?qū)⒃l(fā)性癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞所需的染色質(zhì)變異體的性質(zhì)和數(shù)量，取決于細(xì)胞的起源類型以及細(xì)胞狀態(tài)之間的能量限制。細(xì)胞狀態(tài)之間能量水平（ΔG）的微小差異即可導(dǎo)致自發(fā)轉(zhuǎn)變，這表明細(xì)胞具有更高的可塑性（pliancy, 細(xì)胞在不改變自身狀態(tài)和相關(guān)功能的情況下，容忍基因和/或染色質(zhì)變異的能力）。雖然該術(shù)語最初是用來描述細(xì)胞對遺傳變異體的耐受能力，但我們認(rèn)為它可以擴(kuò)展到涵蓋細(xì)胞對染色質(zhì)變異體以及突變體的耐受能力。
?表觀基因組重編程
與表觀基因組隨機(jī)性相反，表觀基因組重編程描述了細(xì)胞對環(huán)境信號的主動響應(yīng)，即染色質(zhì)變異的獲得，從而導(dǎo)致新的細(xì)胞狀態(tài)（圖4a）。一個顯著的例子是雄激素依賴性前列腺腺癌向雄激素非依賴性神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌（NEPC）的轉(zhuǎn)分化。這種表型轉(zhuǎn)變通常與對雄激素剝奪療法的耐藥性發(fā)展相關(guān)。向NEPC的轉(zhuǎn)分化與染色質(zhì)變異的積累有關(guān)，這是由于DNA甲基化和染色質(zhì)可及性的改變所致。染色質(zhì)因子，例如EZH2和特定的轉(zhuǎn)錄因子，在這一轉(zhuǎn)變過程中起著關(guān)鍵作用。譜系追蹤研究證實，轉(zhuǎn)分化是前列腺癌治療耐藥性的一種非遺傳機(jī)制，由表觀基因組重編程介導(dǎo)。
在管腔型乳腺癌（luminal breast cancers）中，內(nèi)分泌治療耐藥性可能由表觀基因組重編程驅(qū)動，這涉及組蛋白修飾的復(fù)雜且全局性的變化，從而觸發(fā)細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。具體而言，DTP細(xì)胞表現(xiàn)出異染色質(zhì)標(biāo)記H4K20me3、H3K9me2和H3K27me3的富集；抑制生成這三種標(biāo)記的甲基轉(zhuǎn)移酶可減少DTP細(xì)胞的出現(xiàn)。相反，在三陰性乳腺癌中，化療耐藥性依賴于染色質(zhì)變體的獲得，而這種變體的獲得是由H3K27me3和DNA甲基化的重編程介導(dǎo)的。抑制EZH2足以將化療敏感的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為DTP狀態(tài)，但也可以阻止已建立化療耐藥狀態(tài)的癌細(xì)胞的增殖。
腫瘤微環(huán)境的變化或抗癌治療引起的應(yīng)激可通過激活轉(zhuǎn)錄因子啟動表觀基因組重編程，特別是先鋒因子（pioneer factors, 具有獨(dú)特能力的轉(zhuǎn)錄因子，能夠啟動封閉染色質(zhì)的打開。），能夠識別致密染色質(zhì)內(nèi)的靶DNA序列，從而觸發(fā)局部染色質(zhì)重塑，這不僅發(fā)生在發(fā)育過程中，也發(fā)生在癌癥中。例如，在結(jié)腸癌小鼠模型中，先鋒因子SOX9對于癌癥的發(fā)生至關(guān)重要，而SOX9介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生涉及發(fā)育基因的局部染色質(zhì)重塑。二價修飾的基因啟動子也能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的表觀基因組標(biāo)記的重新分布。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，二價ZEB1啟動子控制著參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)變積極促進(jìn)了轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞狀態(tài)的形成，使乳腺癌細(xì)胞能夠更容易地對環(huán)境信號做出反應(yīng)。
表觀基因組記憶
暴露于壓力和外部刺激可啟動持久的表觀基因組重編程，即使在恢復(fù)穩(wěn)態(tài)后也能維持，從而在細(xì)胞上留下表觀基因組“記憶”，影響其對未來壓力的反應(yīng)。小鼠腫瘤起始模型中炎癥反應(yīng)最能體現(xiàn)這一現(xiàn)象，其中表觀基因組記憶被認(rèn)為可以降低特定細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的能量屏障（圖4a）。例如，對胰腺癌小鼠模型和類器官模型的scATAC-seq研究表明，暴露于炎癥應(yīng)激的KRAS突變細(xì)胞會積累染色質(zhì)變體，表明其從腺泡細(xì)胞狀態(tài)向腫瘤細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。這種在轉(zhuǎn)化前對染色質(zhì)狀態(tài)的“啟動（priming）”與之前的研究結(jié)果一致，這些研究表明，胰腺腫瘤發(fā)生早期炎癥誘導(dǎo)的表觀基因組記憶的特征是化生相關(guān)基因上H3K4me1的增加。在肺癌小鼠模型轉(zhuǎn)移進(jìn)展的研究中也報道了類似的表觀基因組啟動（epigenomic priming）現(xiàn)象。同樣，傷口愈合會導(dǎo)致印記表觀基因組記憶，其特征是組蛋白2A第119位賴氨酸的泛素化（H2AK119ub）減少，這種染色質(zhì)變體與腫瘤發(fā)生增強(qiáng)有關(guān)。在接受癌癥治療的患者中，目前尚不清楚第一輪癌癥治療是否能在殘留癌細(xì)胞中誘導(dǎo)表觀基因組記憶，從而影響后續(xù)治療的反應(yīng)。
選擇動態(tài)性
盡管表觀基因組重編程是公認(rèn)的癌癥標(biāo)志之一，但該領(lǐng)域的一個核心問題在于，選擇壓力是否傾向于那些已經(jīng)具備高潛能的癌細(xì)胞亞群，使其能夠進(jìn)入各種細(xì)胞狀態(tài)，還是這種壓力驅(qū)動著一種適應(yīng)性過程，促使癌細(xì)胞向不同的細(xì)胞狀態(tài)演化。隨著單細(xì)胞表觀基因組檢測、譜系追蹤工具和計算方法的最新進(jìn)展，我們現(xiàn)在有望揭示驅(qū)動腫瘤演化的表觀基因組變異相關(guān)的選擇動態(tài)。
關(guān)于腫瘤起始的單細(xì)胞研究很少（圖4b）。在肺癌小鼠模型中，癌前細(xì)胞中觀察到細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)定性（即吸引盆地擴(kuò)大）的瞬時增加。這一發(fā)現(xiàn)可被解釋為癌癥中表觀基因組不穩(wěn)定性（epigenomic instability, 細(xì)胞無法長期維持表觀基因組標(biāo)記的完整性。）促進(jìn)了罕見表觀克隆的后續(xù)擴(kuò)增。在其他癌癥模型中也觀察到了腫瘤發(fā)生初期細(xì)胞間表觀基因組不穩(wěn)定性類似的增加。在黑色素瘤中，已鑒定出一個空間局部化的微環(huán)境，癌前上皮細(xì)胞在該微環(huán)境中通過與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用獲得腫瘤起始潛能，這表明在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境信號下，許多細(xì)胞都具有腫瘤起始的潛能。
單細(xì)胞條形碼研究和基于克隆的實驗為癌癥獲得治療后耐藥性的過程提供了重要的見解（圖4c）。未經(jīng)治療的癌細(xì)胞能夠隨機(jī)地在DTP前狀態(tài)之間循環(huán)。在治療選擇壓力下，這些DTP前細(xì)胞可以通過活躍的表觀基因組介導(dǎo)的過程轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止的DTP狀態(tài)。這種靜止的DTP狀態(tài)是可逆的，癌細(xì)胞在停止治療后可以重新獲得對藥物的敏感性。然而，從非循環(huán)DTP到循環(huán)DTP的轉(zhuǎn)變——這種轉(zhuǎn)變與非遺傳驅(qū)動的癌癥進(jìn)展相關(guān)，即使接受了治療——僅由一部分DTP細(xì)胞實現(xiàn)。這些細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄程序，將其代謝重定向到脂肪酸氧化。代謝通路在多種模型中均與基因表達(dá)程序的啟動密切相關(guān)：例如，在接受化療的乳腺癌中，一些參與代謝的基因被鑒定為瞬時DTP前細(xì)胞狀態(tài)特征的一部分，而蛋氨酸失衡則維持了耐藥細(xì)胞狀態(tài)。進(jìn)一步的研究表明，多種非遺傳性的耐藥細(xì)胞狀態(tài)可以從同一癌細(xì)胞群中產(chǎn)生，每種狀態(tài)都由DTP前狀態(tài)的分子差異決定，并由治療策略（所用藥物和劑量）進(jìn)行獨(dú)特選擇。
要全面了解腫瘤的演變，需要對細(xì)胞后代及其表觀基因組特征進(jìn)行體內(nèi)監(jiān)測和空間定位。這些方法對于確定細(xì)胞狀態(tài)如何演變至關(guān)重要，并有助于研究人員設(shè)計針對腫瘤演變過程中動態(tài)表觀基因組過程的有效抗癌療法。
靶向表觀基因組異質(zhì)性
與DNA序列突變不同，染色質(zhì)變異可以通過化學(xué)試劑進(jìn)行靶向治療。這一特性引發(fā)了人們對開發(fā)靶向表觀基因組過程的潛在療法的濃厚興趣。
臨床試驗的啟示
目前，僅有九種表觀遺傳藥物獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)，可作為單藥療法用于癌癥治療（表2）。這些藥物大多獲準(zhǔn)用于血液腫瘤，僅有兩種獲準(zhǔn)用于實體瘤。除這兩種藥物外，迄今為止研究的大多數(shù)表觀遺傳療法作為單藥療法治療實體惡性腫瘤均無效；接受治療的患者在I期臨床試驗中未表現(xiàn)出客觀的治療反應(yīng)，且毒性反應(yīng)嚴(yán)重。這種有限的成功可能歸因于表觀遺傳療法缺乏特異性以及藥物在實體瘤中的生物利用度低。正在進(jìn)行的臨床試驗正在測試表觀遺傳療法與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用，旨在提高患者對標(biāo)準(zhǔn)治療或新型療法（例如免疫檢查點抑制劑）的反應(yīng)。在此，我們將這些試驗的設(shè)計與我們已建立的概念框架聯(lián)系起來進(jìn)行探討，該框架旨在描述表觀基因組異質(zhì)性如何指導(dǎo)腫瘤演變。
目前正在進(jìn)行的將表觀遺傳療法與傳統(tǒng)抗癌藥物相結(jié)合的臨床試驗遵循三種主要策略。第一種策略旨在克服與已知染色質(zhì)變異相關(guān)的、對現(xiàn)有表觀遺傳藥物敏感的、對標(biāo)準(zhǔn)治療產(chǎn)生耐藥性的腫瘤。這種方法在特定癌癥類型中顯示出前景，例如鉑類耐藥卵巢癌（II期臨床試驗，NCT00477386）和激素耐藥雌激素受體陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌（III期臨床試驗，NCT02482753）。在這些試驗中，當(dāng)檢測到治療期間癌癥進(jìn)展的跡象時，會將基于抑制特定DNMT和組蛋白去乙酰化酶的表觀遺傳療法添加到標(biāo)準(zhǔn)治療方案中。因此，該方法旨在通過強(qiáng)制細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換來靶向表觀基因組變異引導(dǎo)的腫瘤演變，從而使腫瘤細(xì)胞重新獲得對標(biāo)準(zhǔn)療法的敏感性。
第二種方法是在給予標(biāo)準(zhǔn)抗癌藥物之前，通過表觀遺傳藥物預(yù)處理來啟動癌細(xì)胞，旨在最大限度地提高抗癌治療的療效。迄今為止，采用這種設(shè)計的研究很少。例如，一項正在進(jìn)行的III期臨床試驗（II/III期NCT02159820）正在評估在開始標(biāo)準(zhǔn)鉑類和紫杉醇治療之前，使用低劑量DNMT抑制劑對初治卵巢癌患者進(jìn)行預(yù)處理的效果。該策略旨在通過在開始標(biāo)準(zhǔn)一線治療之前選擇性地靶向DTP前細(xì)胞狀態(tài)，來降低腫瘤的表觀基因組異質(zhì)性，從而防止與癌癥復(fù)發(fā)相關(guān)的表觀基因組重編程。從臨床角度來看，與聯(lián)合治療試驗相比，這種研究設(shè)計還具有最大限度降低毒性的優(yōu)勢，因為聯(lián)合治療試驗中觀察到了嚴(yán)重的毒性。
第三種策略在2020年近一半的已報道試驗中被采用，這些試驗將表觀遺傳藥物與抗癌療法聯(lián)合使用，旨在利用表觀遺傳療法最大化免疫療法的效果。這些療法的聯(lián)合應(yīng)用有可能通過解除內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他重復(fù)序列的抑制，將免疫抑制性（“冷”）腫瘤轉(zhuǎn)化為免疫開放性（“熱”）腫瘤。解除抑制會導(dǎo)致雙鏈RNA的產(chǎn)生，從而觸發(fā)癌細(xì)胞的抗病毒先天免疫反應(yīng)，并使癌細(xì)胞能夠被免疫細(xì)胞識別，這一過程被稱為病毒模擬（詳見其他文獻(xiàn)的綜述）。在這種試驗設(shè)計中，表觀遺傳療法會增加腫瘤的初始表觀基因組變異，而宿主免疫細(xì)胞則充當(dāng)腫瘤演化的調(diào)控者。此外，表觀遺傳療法還可以驅(qū)動免疫細(xì)胞分化為更具反應(yīng)性的表型，從而克服對免疫檢查點療法的耐藥性。單細(xì)胞表觀基因組學(xué)方法對于優(yōu)化這些免疫再激活機(jī)制的時機(jī)和效率至關(guān)重要，例如，通過確定所有腫瘤細(xì)胞是否反應(yīng)一致，或者識別哪些腫瘤細(xì)胞群是免疫系統(tǒng)的靶點。
未來展望
目前的研究方向和臨床前研究主要集中在三個相互關(guān)聯(lián)的策略上，以限制腫瘤的發(fā)生和/或進(jìn)展：靶向表觀遺傳驅(qū)動的細(xì)胞狀態(tài)脆弱性；逆轉(zhuǎn)獲得的染色質(zhì)變異或阻止由表觀基因組重編程引導(dǎo)的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變；以及限制腫瘤細(xì)胞群體變異的程度，從而限制表觀基因組異質(zhì)性（圖5）。
第一種策略是靶向干細(xì)胞樣細(xì)胞或DTP細(xì)胞在治療過程中激活的促生存通路（圖5a）。例如，多種癌癥模型中的DTP細(xì)胞依賴于代謝酶，例如磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4），以防止通過鐵死亡而死亡。抑制這些酶可以選擇性地殺死DTP細(xì)胞，并增強(qiáng)抗癌療法的療效。在包括HER2陽性乳腺癌和肺癌在內(nèi)的多種癌癥中，DTP細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)了類似的脆弱性。在白血病中，對溴結(jié)構(gòu)域和末端外基序（BET）蛋白（BRD2-BRD4和BRDT）抑制劑治療的非遺傳耐藥性與特定通路相關(guān)，例如WNT-β-catenin通路，該通路可以作為靶點來克服治療耐藥性。該策略利用的是新出現(xiàn)的DTP或治療耐藥細(xì)胞狀態(tài)的非遺傳脆弱性，而不是直接針對表觀基因組脆弱性。
第二種策略側(cè)重于識別使細(xì)胞群能夠跨越能量屏障的必要機(jī)制（圖5b）。靶向參與這些轉(zhuǎn)變的表觀基因組過程，可以通過使癌細(xì)胞恢復(fù)到未經(jīng)治療（DTP前）狀態(tài)來恢復(fù)其對癌癥治療的敏感性，或者通過阻止癌細(xì)胞向DTP狀態(tài)的轉(zhuǎn)變來提高抗癌療法的療效。特定的組蛋白去甲基化酶，例如肺癌和黑色素瘤中的KDM5A，或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和三陰性乳腺癌中的KDM6A和KDM6B，均與多種癌癥類型的這些轉(zhuǎn)變有關(guān)，抑制這些酶可以部分阻止治療過程中DTP細(xì)胞的出現(xiàn)。同樣，靶向驅(qū)動細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)錄因子（例如黑色素瘤中的視黃酸受體RXRγ）或增強(qiáng)子轉(zhuǎn)換（例如急性髓系白血病）可以預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。強(qiáng)制逆轉(zhuǎn)與治療耐藥性相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變可以恢復(fù)治療敏感性。例如，對雄激素拮抗療法耐藥的前列腺癌可以通過EZH2抑制劑或Janus激酶抑制劑或成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）抑制劑治療而重新獲得治療敏感性。此外，阻斷向易轉(zhuǎn)移細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，例如肺腺癌中RUNX轉(zhuǎn)錄因子激活所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)變，可能有助于限制癌細(xì)胞擴(kuò)散。一些有前景的研究還表明，通過靶向腫瘤形成之前發(fā)生的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的非遺傳機(jī)制，可以延緩腫瘤發(fā)生。
第三種策略旨在最大限度地減少癌細(xì)胞群體的變異性，從而減少異常細(xì)胞群體的出現(xiàn)，這些異常細(xì)胞群體更容易在治療或應(yīng)激反應(yīng)中轉(zhuǎn)變?yōu)閱栴}表型（圖5c）。例如，乳腺癌中表觀基因組酶（如KDM5B）的過表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的增強(qiáng)有關(guān)，而轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性又與內(nèi)分泌治療耐藥風(fēng)險的增加相關(guān)。降低這種異質(zhì)性可以降低產(chǎn)生耐藥癌細(xì)胞群體的概率。
展望未來，至關(guān)重要的是要加深我們對遺傳和非遺傳腫瘤演化過程各自貢獻(xiàn)的理解。此類研究對于制定及時合理的策略至關(guān)重要，以便在相關(guān)細(xì)胞類型中于適當(dāng)?shù)臅r間點攔截非遺傳腫瘤演化。
結(jié)論
單細(xì)胞表觀基因組學(xué)技術(shù)正在徹底改變我們對表觀遺傳過程在腫瘤演化中作用的理解，并使我們能夠模擬這些過程對腫瘤演化過程中細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的影響。隨著這些技術(shù)的成熟和數(shù)據(jù)質(zhì)量的提高，越來越多的癌癥患者單細(xì)胞表觀基因組學(xué)研究有望在為靶向表觀基因組異質(zhì)性的新型治療策略的設(shè)計提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。單細(xì)胞表觀基因組學(xué)研究前所未有的分辨率與表觀遺傳療法設(shè)計的復(fù)興不謀而合。新興的靶向策略，例如蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）和抗體藥物偶聯(lián)物，有望開發(fā)出新一代表觀遺傳療法，以解決現(xiàn)有小分子藥物特異性差的問題。首批靶向含溴結(jié)構(gòu)域蛋白的PROTACs目前正處于I期臨床試驗階段（NCT04965753），同時，一些化合物正在研發(fā)中，旨在靶向?qū)Ρ碛^基因組異質(zhì)性至關(guān)重要的表觀遺傳復(fù)合物，例如PRC2或Brahma相關(guān)因子（BAF）復(fù)合物（SWI/SNF家族成員）。此外，組蛋白去乙?；敢种苿┮雅c癌細(xì)胞特異性抗體聯(lián)合使用，用于靶向HER2擴(kuò)增的乳腺癌和EGFR陽性癌癥，這表明表觀遺傳療法具有靶向遞送至腫瘤細(xì)胞的潛力。這些創(chuàng)新方法，以及對表觀基因組異質(zhì)性在腫瘤演變中作用的深入理解，將有助于在未來幾年內(nèi)通過實現(xiàn)這些療法的精準(zhǔn)給藥時間和細(xì)胞特異性靶向，降低表觀遺傳療法相關(guān)的風(fēng)險。這些改進(jìn)對于提高這些療法的療效、減少其不良反應(yīng)至關(guān)重要，從而改善患者的治療效果。
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