前言：
大家都知道CRISPR-Cas9有脫靶效應(yīng)，并且每個sgRNA的效率都不一樣的，因此在做正式實驗之前，我們要驗證sgRNA的效率，之后優(yōu)中選優(yōu)。還是那句話，同樣的目的有很多不同的方案，我了解到的有：
- 使用sgRNA靶點篩選試劑盒，優(yōu)點快速、工作量小且可以大批量進(jìn)行；
- 將sgRNA-pSpCas9轉(zhuǎn)入293細(xì)胞中，提取293細(xì)胞基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的DNA片段后，使用T7核酸內(nèi)切酶，驗證sgRNA切割效率；
歡迎大家補(bǔ)充，互相交流，提供更方便快捷的方案，由于我們實驗室購買試劑盒時間長，相對困難，且sgRNA的切割效率的驗證還是活細(xì)胞內(nèi)效率最為準(zhǔn)確。經(jīng)過課題組師兄DZ的優(yōu)化，一般我們針對一個基因的簡單敲除，設(shè)計2個sgRNA即可，并且選擇方案2進(jìn)行驗證。
接前期推文，我們做了一手漂亮的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，如何確定sgRNA切割活性，這條sgRNA到底還要不要，就看今天了。
實驗正文
1. 實驗準(zhǔn)備
細(xì)胞：已轉(zhuǎn)染sgRNA-pSpCas9質(zhì)粒的293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率70%以上。
試劑準(zhǔn)備：<u>T7 Endonuclease I</u> 核酸內(nèi)切酶及相應(yīng)buffer，基因組DNA提取試劑盒，目的基因片段primers，NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶（其他公司的高保真DNA聚合酶也可以，一定要高保真），瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑，膠回收試劑盒
儀器：瓊脂糖凝膠電泳儀，看膠儀
2. 實驗步驟
（1）293細(xì)胞轉(zhuǎn)染
在轉(zhuǎn)染前一天，將293細(xì)胞以單細(xì)胞分散狀態(tài)種至6孔板中，組別設(shè)計為：293未轉(zhuǎn)染組（negative control），293轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染當(dāng)天293細(xì)胞融合度為3040%，將2.02.5 μg pSpCas9_sgRNA質(zhì)粒使用lipofectamine 3000按照常規(guī)條件轉(zhuǎn)染（具體細(xì)節(jié)請參照上期文章），72 h內(nèi)進(jìn)行下一步實驗。
注意事項：由于293細(xì)胞貼壁不牢，很容易被吹落，因此在滴加轉(zhuǎn)染試劑的時候要十分輕柔，換液時要更加小心沿壁加入，并且培養(yǎng)基要提前預(yù)溫。
（2）提取293細(xì)胞基因組DNA
這里我們使用的是天根公司的基因組DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒要求即可。
實驗細(xì)節(jié)調(diào)整：原protocol可能需要消化細(xì)胞后再加裂解液，在這里由于293細(xì)胞非常容易脫落，因此我選擇不消化細(xì)胞，棄去上清，直接使用孔種的培養(yǎng)基吹落細(xì)胞，移入1.5 ml EP管離心去除上清后，直接加入裂解液吹打，之后步驟同試劑盒要求一樣。
（3）使用高保真DNA聚合酶完成PCR實驗
一定要使用高保真酶的原因是，T7 EI內(nèi)切酶的原理是識別突變位點，所以如果使用的DNA聚合酶不夠保真，在PCR過程擴(kuò)增錯誤，引入突變，則會影響后續(xù)結(jié)果。在這里需要提醒的是，任何DNA聚合酶的使用，一定要嚴(yán)格查閱相應(yīng)說明書，確定實驗條件。我們使用的是NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，根據(jù)說明書指示，Q5 DNA聚合酶做的PCR實驗，其primer的退火溫度和普通我們使用的不一樣，需要使用NEB公司的Tm calculator工具計算得出。
（4）膠回收PCR擴(kuò)增出的目的序列
膠回收的原則就是，量大質(zhì)優(yōu)，嚴(yán)格按照說明書操作即可。
（5）T7 Endonuclease I 酶切實驗
配置實驗反應(yīng)
按照以下條件annealing
設(shè)置酶切反應(yīng)后，37 ℃孵育15分鐘
（6）瓊脂糖凝膠電泳，預(yù)測分子量大小<1 kb，使用 1.52%瓊脂糖；分子量大小為110 kb大小時，選用1-1.2%
（7）結(jié)果分析示例
對于左圖
（1）可以看到negative control組中，T7酶并沒有將DNA切斷，可以說明沒有出現(xiàn)基因錯配的情況；
（2）而分別用了sgRNA 1 和sgRNA 2的兩組，均出現(xiàn)了DNA被切割的現(xiàn)象，且切割后的片段長度加起來，恰好等于uncut line。
以上結(jié)果說明，在未轉(zhuǎn)染sgRNA-Cas9組（NC）中，DNA保持了原有的正確序列，轉(zhuǎn)染sgRNA-Cas9質(zhì)粒后的細(xì)胞，基因已經(jīng)被編輯。sgRNA 1和2均可切割，且量條sgRNA的效率差不多，隨手選一條即可。右圖是更加標(biāo)準(zhǔn)的做法，左圖少了blank control 組（不加T7 酶的組）。
小結(jié)
CRISPR-Cas9基因編輯的直接敲除系列，今天寫到這里算是完成了預(yù)實驗部分。這個時候可以把整個方案的流程放在這里權(quán)當(dāng)總結(jié)，并提示之后實驗方向方向：
準(zhǔn)備工作和預(yù)實驗要至少得到以下簡化的實驗結(jié)果：
