20年的一篇circulation research

通訊作者：

1. Both Monocyte-Derived and Resident Macrophages Participate in DiCM Development

Fig 1A：作者首先對5例HC和28例DCM患者的心臟組織進(jìn)行了免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)CD68⁺巨噬細(xì)胞顯著增多。CD15⁺中性粒和CD3⁺T細(xì)胞則沒有明顯增加。
Fig 1B：作者通過對小鼠注射阿霉素 (15 mg/kg) 構(gòu)建了DiCM小鼠模型。造模后小鼠外周血和心臟組織的Tnfa, Il1b, Il6持續(xù)升高。
Fig 1C, D：和A圖一致，流式結(jié)果顯示DiCM小鼠心臟中的CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺巨噬細(xì)胞而不是 CD45⁺CD11b⁺F4/80^-Ly6C^-Ly6G⁺ 中性粒細(xì)胞出現(xiàn)了持續(xù)的增加。(C圖是比例，D圖是數(shù)量)

流式分析策略：
巨噬細(xì)胞：CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺
Ly6C⁺單核 (circulating monocytes)：CD45⁺CD11b⁺F4/80^-Ly6C⁺Ly6G^-
Ly6C^-單核 (patrolling monocytes)：CD45⁺CD11b⁺F4/80^-Ly6C^-Ly6G^-
中性粒細(xì)胞：CD45⁺CD11b⁺F4/80^-Ly6C^-Ly6G⁺

Fig 1E： 為了探究DiCM心臟中增加的巨噬細(xì)胞來源，作者使用了共生鼠。作者給共生鼠注射了阿霉素，14天后檢測了GFP⁺鼠心臟和外周血中的巨噬細(xì)胞?？梢钥吹?，對照GFP⁺小鼠外周血中GFP⁺和GFP^-細(xì)胞數(shù)量類似（血供相通），心臟中則主要還是GFP⁺巨噬。而在誘導(dǎo)了DiCM之后，GFP⁺小鼠心臟中GFP⁺巨噬顯著增多，GFP^-巨噬輕度增加。提示 nonmonocyte-derived macrophages may contribute to the accumulated macrophages in DiCM hearts.
Fig 1G： 同時作者也使用了示蹤鼠進(jìn)行了驗證。作者使用CX3CR1^CreER/+ Rosatd^TOMATO/+小鼠，阿霉素誘導(dǎo)了DiCM后，對tdTOMATO^-CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺外周趨化來的巨噬和tdTOMATO⁺CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺ 組織原位巨噬的檢測發(fā)現(xiàn)外周趨化來的巨噬比例持續(xù)減少，組織原位巨噬持續(xù)增加。

2. Different Origins of Macrophages Exhibit Distinct Activity and Function in DiCM

由于心臟巨噬細(xì)胞具有不同的來源和功能，作者隨后想要去探究DiCM中的macrophage origin and metergasis。
Fig 2A： 流式結(jié)果顯示DiCM組織中，CD45⁺F4/80⁺CD11b⁺Ly6C⁺促炎巨噬顯著比修復(fù)性CD45⁺F4/80⁺CD11b⁺CD206⁺更多。但隨著DiCM進(jìn)展，這種差異逐漸消失。
Fig 2B： 此外作者發(fā)現(xiàn)在CX3CR1^CreER/+ Rosa^tdTOMATO/+ DiCM心臟中，tdTomato⁺CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺組織原位巨噬主要向CD206⁺ reparative phenotype分化而tdTomato^-CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺主要展示出Ly6C⁺ proinflammatory character。
Fig 2C： 共生鼠的結(jié)果也提示GFP+ parabiont 心臟中，F(xiàn)4/80⁺CD11c⁺促炎巨噬主要是monocyte-derived GFP^?的，而homotypic GFP⁺ 細(xì)胞occupied most F4/80⁺CD206⁺ reparative macrophages。
Fig 2D： 隨后作者使用氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除了巨噬細(xì)胞。使用脂質(zhì)體之后，DiCM心臟中的F4/80⁺總巨噬和CD11C⁺促炎巨噬顯著減少，而CD206⁺修復(fù)性巨噬則沒有受到顯著影響。
Fig 2E： 給予氯膦酸鹽脂質(zhì)體之后，DiCM鼠的心功能改善了。
Taken together, these findings indicate that the proinflammatory macrophages are mainly generated from blood monocytes, and their removal may be beneficial in restoring cardiac function in DiCM mice.

隨后作者使用骨髓移植驗證了前面的結(jié)論。
Fig 2F： 作者將GFP⁺ bone marrow cells移植到γ-irradiated wild-type mice，并檢測了受體鼠心臟的巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示受體鼠心臟的F4/80⁺CD11C⁺促炎巨噬細(xì)胞主要是GFP⁺的，而F4/80⁺CD206⁺修復(fù)性巨噬細(xì)胞主要是GFP^-的。
Fig 2G-H： 在明確了修復(fù)性巨噬主要來源于組織原位巨噬之后，作者探究了DiCM心臟中巨噬細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示心臟巨噬細(xì)胞存在持續(xù)增殖。且增殖陽性的細(xì)胞中修復(fù)性巨噬占多數(shù)，而CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺BrdU^-細(xì)胞占據(jù)了絕大多數(shù)的Ly6C⁺促炎巨噬。
Fig 2I： 對tdTomato⁺CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺組織原位巨噬和 tdTomato^-CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺ 促炎巨噬的增殖監(jiān)測也顯示組織原位巨噬具有更強(qiáng)的增殖活性。

3. SR-A1 Is Required for the Resident Reparative Macrophage Proliferation in DiCM

Fig 3A： 為了探究DiCM心臟中修復(fù)性組織原位巨噬細(xì)胞增殖的機(jī)制，作者對小鼠DiCM心臟進(jìn)行了RNAseq。結(jié)果顯示SR-A1是最顯著上調(diào)的基因之一。（1個對照3個病例嗎？而且為什么不提組織原位巨噬來測？）
Fig 3B-C： western和qpcr結(jié)果也顯示病程中SR-A1持續(xù)上調(diào)。免疫熒光的結(jié)果也顯示DCM患者心臟中SR-A1巨噬增加。

We next determined the effect of SR-A1 ablation on macrophage biology in DiCM mice.
Fig 3D-E： 流式結(jié)果顯示SR-A1敲除鼠DiCM心臟中的巨噬細(xì)胞顯著增多，CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁺促炎單核增多，Ly6C^- patrolling單核和 CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺CD206⁺則減少。
Fig 3F： 與前面的結(jié)果一致，qpcr的結(jié)果也顯示SR-A1^?/? DiCM心臟的促炎活化更顯著，修復(fù)性基因的表達(dá)則較低。

The role of SR-A1 in macrophage proliferation was further assessed by immunofluorescence staining and FACS analysis.
Fig 4A： Ki67⁺CD68⁺的增殖巨噬在SR-A1^?/? DiCM心臟中減少。
Fig 4B-C： 對S期巨噬和CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺BrdU⁺巨噬的檢測也得到了一致的結(jié)果。
Fig 4D： 而且和SR-A1^+/+ controls相比，doxorubicin-administrated SR-A1^?/?心臟中CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁺BrdU⁺促炎巨噬顯著更多，CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺CD206⁺BrdU⁺修復(fù)性巨噬則更低。
Suggesting that SR-A1 deficiency mainly affects the proliferation of reparative macrophages.

隨后作者也通過將GFP⁺SR-A1⁺骨髓移植給γ-irradiated GFP^-SR-A1^?/?和GFP^-SR-A1^+/+ 鼠做了驗證。
Fig 4E： 結(jié)果顯示移植給GFP^-SR-A1^+/+ 鼠的心臟中F4/80⁺GFP^-BrdU⁺原位巨噬顯著增加，移植給GFP^-SR-A1^?/?鼠的心臟則沒有出現(xiàn)這種情況。而且SR-A1 deficiency并沒有影響DiCM心臟中F4/80⁺GFP⁺BrdU⁺單核來源的巨噬。
Fig 4F： 而且只有F4/80⁺CD206⁺GFP^-BrdU⁺ 修復(fù)性原位巨噬來源的增殖細(xì)胞而不是 F4/80⁺CD11c⁺GFP⁺BrdU⁺促炎巨噬來源的增殖細(xì)胞在doxorubicin-treated SR-A1^?/? recipients hearts中減少。
These findings collectively indicate that SR-A1 deficiency may only impair resident reparative macrophage proliferation in DiCM hearts.

4. Macrophage SR-A1 Deficiency Exacerbates Doxorubicin-Induced Cardiac Dysfunction and Pathological Remodeling in Mice

由于SR-A1在DiCM心臟中可能參與了修復(fù)性組織原位巨噬細(xì)胞的增殖，作者隨后探究了它對DiCM心臟心功能的影響。結(jié)果顯示髓系細(xì)胞特異性SR-A1^?/?鼠在誘導(dǎo)了DiCM后心功能更差，心肌損傷更重，炎癥反應(yīng)更強(qiáng)，巨噬細(xì)胞增殖也下降。

5. SR-A1 Mediates Resident Macrophage Proliferation Through Activation of c-Myc in DiCM

Fig 6A： 為了探究SR-A1影響心功能的下游機(jī)制，作者對SR-A1^+/+ DiCM和SR-A1^-/- DiCM心臟進(jìn)行了RNAseq。其中多個macrophage self-renewal genes, 包括 c-Myc, Klf4, Akt, 和 Stat3在SR-A1^?/? DiCM中下調(diào)。
Fig 6B： Silencing c-Myc by RNA interference inhibited cell proliferation in both SR-A1+/+ and SR-A1?/? macrophages。

將SR-A1^+/+和SR-A1^-/-小鼠心臟F4/80⁺巨噬分選出來，轉(zhuǎn)染c-Myc- siRNAs或用Dox-pretreated cardiomyocytes conditioned media (CM) 孵育 24 h），對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了檢測。

Fig 6C： 在人DCM心臟中，c-Myc 和 SR-A1在CD68巨噬中也存在共定位。
Fig 6D： Dox預(yù)處理心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)SR-A1^+/+巨噬中c-Myc的表達(dá)，在SR-A1^-/-巨噬中則無差異。
Fig 6E： 在DiCM小鼠，c-Myc的mRNA水平在修復(fù)性巨噬細(xì)胞中顯著上調(diào)，而且這種現(xiàn)象was attenuated by SR-A1 ablation。
Fig 6F： 此外，si掉 c-Myc 在SR-A1^+/+和SR-A1^?/? 巨噬中都抑制了巨噬細(xì)胞增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如PU.1 和 Irf4的表達(dá)。
Fig 6G： 然而，c-Myc knockdown并沒有影響促炎性巨噬(either F4/80⁺CD11c⁺ or F4/80⁺CD11c⁺BrdU⁺)
Fig 6H： 相反的，SR-A1^+/+巨噬中的c-Myc silencing引起了修復(fù)性巨噬 (both F4/80⁺CD206⁺ 和 F4/80⁺CD206⁺BrdU⁺) 的顯著下降，這個效應(yīng)was blunted by SR-A1 deficiency。
Fig 6I： The indispensable role of SR-A1 and c-Myc in the proliferation of reparative macrophages was also confirmed by EdU staining
Fig 6J： 此外，在使用doxorubicin預(yù)處理心肌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基刺激后，c-Myc在SR-A1+/+ macrophages的核中顯著聚集。在SR-A1^?/? macrophages中則沒有。

Collectively, these findings suggest that SR-A1 may mediate resident reparative macrophage proliferation through the TAK1-MKK4 (MAPK kinase kinase 4)-P38-c-Myc-SIRT1 pathway in DiCM. （附件）

6. Selective Manipulation of Macrophage c-Myc Influences Murine DiCM Progression

Fig 7A： 為了進(jìn)一步明確SR-A1-c-Myc通路在DiCM病理過程中的作用，沉默或過表達(dá)巨噬細(xì)胞c-Myc的慢病毒was produced using the SP-C1 promoter。

SP-C1看起來是巨噬細(xì)胞特異性啟動子，可以拿來做lentivirus

Fig 7B-D： c-Myc的 Knock-down 抑制了巨噬細(xì)胞增殖，惡化了DiCM的心功能，而且這種現(xiàn)象在SR-A1^?/?鼠中更顯著。
Fig 7E-G： 反過來，過表達(dá)c-Myc 刺激了巨噬細(xì)胞增殖，并在SR-A1^+/+和 SR-A1^?/?鼠中都顯著恢復(fù)了doxorubicin-impaired 心功能。

As such, these results reveal that c-Myc confers a beneficial action to antagonize DiCM development by promoting reparative macrophage proliferation.

用的鼠子和流式的做法