今天分享一篇利用單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組來(lái)研究玉米氣孔開(kāi)合的文章，河大宋校長(zhǎng)發(fā)的，做的挺好挺全面的。
表皮作為葉上最外層細(xì)胞，作為第一道屏障，起著植物和外界互作的重要作用，并參與各種各樣的生物和非生物脅迫。作為表皮中重要的氣孔細(xì)胞，它決定植物光合作用和水分利用效率，來(lái)迅速響應(yīng)變化的環(huán)境條件。
在這篇文章中作者的樣品總共有兩部分：
1）單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組的樣品：3個(gè)玉米的葉表皮，1個(gè)玉米葉原基。
2）RNA-seq：WT和ZmMUTE突變體中收集富含表皮原細(xì)胞（PDCs）、保衛(wèi)母細(xì)胞（GMC）和幼嫩保衛(wèi)細(xì)胞與副衛(wèi)細(xì)胞（YGCs-YSCs）的三個(gè)氣孔發(fā)育階段的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
葉片表皮細(xì)胞圖譜
對(duì)于葉片表皮的單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，聚類顯示細(xì)胞可以分為6個(gè)不同的類型（下圖）：葉肉細(xì)胞（MCs），維管束鞘細(xì)胞（BSCs），具有花青素合成的扁平細(xì)胞（PCs-A），缺乏花青素合成的扁平細(xì)胞（PCs-N），氣孔保細(xì)胞（GCs），氣孔副衛(wèi)細(xì)胞（SCs）。
2. 保衛(wèi)細(xì)胞中調(diào)控氣孔的相關(guān)基因
許多文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了GC中的淀粉降解、葉綠體活性和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉上具有重要的功能。但是GC中的基因是如何調(diào)控氣孔的開(kāi)閉的還并未完全解決。因此，從獲得玉米的表皮細(xì)胞圖譜將有助于解析氣孔調(diào)控的關(guān)鍵作用模型。
首先，葉綠體是GC參與滲透調(diào)節(jié)（osmotic regulation）的特征之一。作者發(fā)現(xiàn)光收集復(fù)合物I和II（LHCI和LHCII）、光合作用I和II的反應(yīng)中心（PSI和PSII）以及C4途徑的初始羧化階段的相關(guān)基因都在GCs中低表達(dá)，而參與線性電子傳遞的鐵氧還蛋白NADP+氧化還原酶 (FNR) 低表達(dá)，而依賴于NAD(P)H脫氫酶 (NDH) 循環(huán)電子傳遞的一種組分，亞復(fù)合物b4的光合NDH亞基 (PnsB4) 在GC中高表達(dá)，這些結(jié)果表明在GCs中光分應(yīng)主要產(chǎn)生ATP（下圖A）。
其次，作者查看了淀粉代謝合成相關(guān)基因的表達(dá)，因?yàn)橛醒芯勘砻鞯矸?糖的轉(zhuǎn)化使得細(xì)胞滲透壓改變從而調(diào)控氣孔的開(kāi)閉。作者發(fā)現(xiàn)GCs中編碼淀粉代謝相關(guān)蛋白的基因高表達(dá)，并且在BSCs中也觀察到了不同的淀粉代謝基因的高表達(dá)，這說(shuō)明淀粉的理化性質(zhì)可能在BSCs和GCs之間存在差異。
最后，因?yàn)橛醒芯勘砻鳚B透調(diào)節(jié)信號(hào)控制氣孔開(kāi)閉主要是通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)調(diào)控的。所以作者查看了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道相關(guān)基因在GC和SC中的表達(dá)規(guī)律。然后發(fā)現(xiàn)編碼鉀離子、鈣離子、氯離子、鐵離子、蘋(píng)果酸的相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均在GCs中特異高表達(dá)。但也有一些其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在SCs中高表達(dá)，這與先前研究結(jié)果一致，有部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在GCs和SCs中都表達(dá)，如硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（下圖B）。
3. GCs和SCs之間鏈接的信號(hào)通路
雖然我們知道GCs可以感知多種環(huán)境因子，比如光照，二氧化碳，植物激素等，但是這些信號(hào)通路是如何參與氣孔開(kāi)閉的調(diào)控的確未知。
ABA可以通過(guò)激酶/磷酸酶介導(dǎo)，次級(jí)代謝產(chǎn)物和GCs中的離子通道調(diào)節(jié)氣孔的開(kāi)閉。所以作者查看了ABA通路上的關(guān)鍵調(diào)控基因，包括OST1，MYB60/96，ZmSLAC1，SLAH3等，發(fā)現(xiàn)都是在GCs中特異表達(dá)的（上圖B，下圖C）。相反的，SnRK2以及ABA的抑制的基因AKS1/3則是在SC中特異表達(dá)。在擬南芥中報(bào)道可以增加ABA level的NRT1.2，發(fā)現(xiàn)在SC中富集，但是在GC中只少量富集。相反的，SnRK2以及ABA的抑制的基因AKS1/3則是在SC中特異表達(dá)。
ZmNRT1.2在擬南芥中的同源基因，在Xenopus laevis oocytes中表達(dá)后ABA含量顯著增加，并且氮轉(zhuǎn)運(yùn)速率增加（下圖A，B）。ZmNRT1.2發(fā)現(xiàn)在SC中富集，但是在GC中只少量富集（下圖C）。
作者接下來(lái)查看了其它激素的情況。PIN1，ZIFL1和生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的2個(gè)基因在GC中特異表達(dá)（上上圖B）。而SAUR32，一個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)的基因則在SC中富集。AtCO2，一個(gè)參與乙烯合成的關(guān)鍵基因在SC中富集。但是ACC基因則在GC和SC中均有表達(dá)。
然后作者查看了和光照有關(guān)的marker基因的表達(dá)規(guī)律。ZmPHOT1，一個(gè)藍(lán)光影響氣孔開(kāi)閉的關(guān)鍵基因在SC中富集。但是其它藍(lán)光調(diào)控關(guān)鍵基因，例如CBC1/2, BLUS1, HY5, CHX20，則在GC中富集 （上上圖C）。
因?yàn)殁}離子是氣孔信號(hào)通路的第二信號(hào)因子，所以作者查看了鈣離子運(yùn)輸方面的功能基因。OSCA1， CNGC15， SCS等在GC中特異表達(dá)。
4. ABA和CO2在GC和SC之間調(diào)控氣孔的響應(yīng)
這一部分和3的結(jié)果，我總覺(jué)得作者講邏輯稍微有點(diǎn)亂，感覺(jué)兩個(gè)部分可以合起來(lái)。
上面作者探索了各種已知的信號(hào)通路基因在GCs和SCs中表達(dá)的異同。這部分可能是重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)ABA和CO2如何影響氣孔的開(kāi)閉的。除了3中的marker基因，作者又重點(diǎn)研究了GCs和SCs的其它特異表達(dá)基因。例如，ZmCYP707A4的表達(dá)與SCs特異，主要參加GCs降解ABA的過(guò)程（上圖C），并且發(fā)現(xiàn)ABCG22基因可能負(fù)責(zé)ABA轉(zhuǎn)運(yùn)，在GCs和SCs中也顯示出高表達(dá)，這說(shuō)明ABA代謝在GCs和SCs之間協(xié)調(diào)氣孔開(kāi)閉的快速動(dòng)態(tài)響應(yīng)。同時(shí)作者通過(guò)定量共聚焦顯微鏡測(cè)量GCs和SCs的體積，從而計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ABA濃度，也證明了GCs和SCs不同的ABA穩(wěn)態(tài)特征可能與氣孔關(guān)閉的協(xié)調(diào)有關(guān)（上圖D，下圖E）。
CO2信號(hào)是由GCs直接感知還是由其他細(xì)胞類型（MCs或SCs）感知，以及這些信號(hào)如何匯聚到氣孔開(kāi)閉信號(hào)通路也是爭(zhēng)議的問(wèn)題。作者查看了CO2傳感器β-CA1的玉米同源基因（Zmβ-CA1），發(fā)現(xiàn)在SCs和MCs中表達(dá)均升高。同時(shí)作者通過(guò)敲除實(shí)驗(yàn)也證明了Zmβ-CA1可以將CO2轉(zhuǎn)化為HCO3-，并且SCs具有參與CO2-HCO3-聚集和CO2傳感的潛力（上圖F-H）。
5. 玉米葉基氣孔發(fā)育軌跡構(gòu)建
為了深入了解GCs和SCs發(fā)育的分子基礎(chǔ)，作者使用葉基樣本進(jìn)行snRNA-seq，分析得到了14個(gè)亞群，使用已經(jīng)發(fā)表的玉米組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)葉基數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，主要細(xì)胞類型有氣孔、葉原基、表皮細(xì)胞、維管束細(xì)胞等（下圖A）。使用比較重要的氣孔marker基因，例如：GC特異表達(dá)的FAMA和SC特異表達(dá)的CST1等都確認(rèn)cluster 11是氣孔細(xì)胞（下圖B）。
為了研究調(diào)控氣孔發(fā)育的網(wǎng)絡(luò)，作者對(duì)氣孔細(xì)胞（亞群11，共含有116個(gè)細(xì)胞核）進(jìn)行擬時(shí)分析發(fā)現(xiàn)GMC的早期發(fā)育階段到幼嫩GCs階段，SMCs的早期階段到幼嫩SCs階段（上圖C）。接著作者查看了氣孔發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)以及定位情況。例如CST在YSCs中表達(dá)量較高（上圖D）；ZmGELP1在YGC-Gs中特異表達(dá)，ZmGELP2則在幼嫩和成熟氣孔中特異表達(dá)（上圖E-F）；ZmMPK12在幼嫩和成熟的氣孔中都可以觀察到（上圖G）；ZmMUM2在在GMCs中特異表達(dá)（上圖H）。作者接著查看了其它氣孔發(fā)育相關(guān)的marker基因在氣孔分化不同時(shí)期的表達(dá)和定位情況（上圖I）。
6. 細(xì)胞壁形成相關(guān)基因?qū)饪组_(kāi)閉狀態(tài)的調(diào)控作用
在氣孔發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞壁經(jīng)歷了多種動(dòng)態(tài)變化，包括兩個(gè)YGCs間細(xì)胞壁的降解形成氣孔、氣孔成熟時(shí)GC壁的增厚以及伴隨氣孔運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)變化。其中最有趣的一個(gè)問(wèn)題是在氣孔的功能壽命中，壁多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)是如何在GCs中協(xié)調(diào)合成、沉積、重組、修飾和降解的。
通過(guò)查看細(xì)胞特異表達(dá)基因，作者發(fā)現(xiàn)了大量與細(xì)胞壁代謝相關(guān)的同源基因，尤其是果膠代謝的兩個(gè)基因，在GMC和SMC階段表達(dá)；與纖維素和木質(zhì)素改性和降解相關(guān)的基因（ZmMUM2等）在4種細(xì)胞類型中均有表達(dá)；與角質(zhì)層代謝相關(guān)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)在SMCs和GMCs中優(yōu)先表達(dá)（下圖A）。但是對(duì)于這些基因是如何影響細(xì)胞壁的形成，以及如何調(diào)控氣孔的狀態(tài)確是未知的。
6. ZmMUTE控制早期GMC時(shí)期的不對(duì)稱分裂以及氣孔的細(xì)胞壁形成
前面作者在軌跡分析中驗(yàn)證過(guò)MUTE在氣孔不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律，這里為了進(jìn)一步研究MUTE在玉米氣孔發(fā)育中的作用，作者從WT和ZmMUTE突變體（缺乏正常的氣孔復(fù)合體）的三個(gè)早期氣孔發(fā)育階段（分別富含PDCs、GMCs和YGCs-YSCs）的樣本獲取bulk RNA-seq數(shù)據(jù)（其實(shí)最后為什么落腳到了這個(gè)基因，我也不清楚，可能實(shí)驗(yàn)室一直在做這個(gè)基因，剛好形成了完整的故事鏈）。將葉基單細(xì)胞數(shù)據(jù)的上調(diào)DEGs與bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的三個(gè)發(fā)育階段的DEGs取交集得到了28個(gè)基因，這些基因都是之前氣孔細(xì)胞鑒定的標(biāo)記基因?；赽ulk RNA-seq數(shù)據(jù)中28個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行聚類，鑒定出18個(gè)基因在WT的GMCs和YGCs YSCs中轉(zhuǎn)錄水平升高，但在突變體相應(yīng)階段大幅下調(diào)。ZmMUTE直接或間接影響的其他重要調(diào)控成分也被鑒定出來(lái)，包括編碼ZmSCS1的基因、包含ICP4結(jié)構(gòu)域的蛋白、兩個(gè)包含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白、一個(gè)蛋白磷酸酶2C家族蛋白和一個(gè)蛋白激酶。這些結(jié)果都為MUTE在氣孔發(fā)育過(guò)程中的作用提供了證據(jù)。
最后，作者根據(jù)在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，以及marker基因總結(jié)了一張調(diào)控氣孔發(fā)育和動(dòng)態(tài)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
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