單細(xì)胞水平的測(cè)序技術(shù)發(fā)展的越來(lái)越快，目前應(yīng)用最多的是集中于mRNA表達(dá)的scRNA-seq和結(jié)合了空間信息的空間轉(zhuǎn)錄組。在此基礎(chǔ)上，還發(fā)展出了其他變種，比如snRNA-seq，scTCR/BCR-seq, scCITE-seq，ECCITE-seq，SPARC-seq，scATAC-seq，等等。這些測(cè)序手段越來(lái)越成熟和細(xì)分。不同的測(cè)序手段適用于不同的情況，研究者們需要綜合考慮樣本來(lái)源、處理方法、研究目的、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用等因素后選擇適合自己課題的測(cè)序方案。
接下來(lái)的一段時(shí)間，我們計(jì)劃深入解讀以上提到的幾種常用的單細(xì)胞組學(xué)測(cè)序方法，包括目的、測(cè)序原理、經(jīng)典文章解讀、數(shù)據(jù)分析工具、圖表復(fù)現(xiàn)等方面。歡迎大家持續(xù)關(guān)注！
Why scCITE-seq：在單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)出現(xiàn)之前，想要研究單個(gè)細(xì)胞的活性和功能，通常是使用一組細(xì)胞表面蛋白的免疫熒光抗體通過(guò)流式細(xì)胞等技術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)。目前常規(guī)的scRNA-seq雖然能夠高通量的輕松測(cè)到成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞內(nèi)的幾乎所有mRNA的表達(dá)水平，但是它卻反而無(wú)法得到那些早期技術(shù)能得到的信息：細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞功能的發(fā)揮最終還是落腳到蛋白上。而從mRNA到蛋白還會(huì)受到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，這導(dǎo)致了mRNA水平和蛋白水平的差異，即mRNA表達(dá)不能精確反應(yīng)當(dāng)前蛋白豐度水平。有文獻(xiàn)表明蛋白表達(dá)差異整體低于mRNA差異[5]。這強(qiáng)調(diào)了同時(shí)考慮蛋白和mRNA表達(dá)水平的重要性。
What is scCITE-seq：CITE-seq全稱為：Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing，是紐約基因組中心技術(shù)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室與Satija實(shí)驗(yàn)室合作開發(fā)的一種多模式單細(xì)胞表型檢測(cè)方法(a multimodal single cell phenotyping method)[6]。它的出現(xiàn)彌補(bǔ)了scRNA-seq無(wú)法同時(shí)獲得單個(gè)細(xì)胞的mRNA和細(xì)胞表面蛋白（注意：該技術(shù)僅檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白，不考慮胞內(nèi)蛋白）表達(dá)的缺點(diǎn)。該技術(shù)通過(guò)帶DNA標(biāo)簽的抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白，同時(shí)用10x的RNA單細(xì)胞測(cè)序來(lái)檢測(cè)全部的mRNA，從而完成同時(shí)獲得mRNA和膜蛋白表達(dá)兩個(gè)維度的信息。（注意本文中的CITE-seq和scCITE-seq是相同含義）
測(cè)序原理
CITE-seq的關(guān)鍵是引入了帶DNA barcode的抗體：
將這種抗體和細(xì)胞懸浮液共孵育，等抗體和對(duì)應(yīng)的細(xì)胞表面蛋白通過(guò)抗原-抗體特異性反應(yīng)充分結(jié)合后，洗掉沒(méi)有結(jié)合上抗原的游離抗體。此時(shí)得到的單細(xì)胞懸液中，每個(gè)細(xì)胞的表面蛋白都與對(duì)應(yīng)的帶DNA標(biāo)簽的抗體結(jié)合了。接下來(lái)將結(jié)合了抗體的細(xì)胞和帶有條形碼的凝膠微珠經(jīng)由微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)形成油包水的微滴(droplet)，獲得單細(xì)胞反應(yīng)體系。然后將微滴中的細(xì)胞裂解，從而讓細(xì)胞內(nèi)的mRNA和細(xì)胞表面蛋白抗體的DNA序列（poly A尾的存在讓抗體上的DNA標(biāo)簽?zāi)苋缤琺RNA一樣和凝珠上的poly T序列結(jié)合）和凝膠珠上的引物結(jié)合。最后通過(guò)文庫(kù)制備過(guò)程后進(jìn)行測(cè)序。
疑問(wèn)與解答
測(cè)了mRNA還不夠嗎？為什么還要測(cè)細(xì)胞表面蛋白？
從mRNA到蛋白出現(xiàn)在細(xì)胞表面還有很長(zhǎng)一段過(guò)程，這導(dǎo)致了兩者之間可能是不一致的。相對(duì)而言，蛋白比mRNA更能反應(yīng)細(xì)胞目前的狀態(tài)。因而同時(shí)測(cè)蛋白和mRNA可以提供不同且互補(bǔ)的信息來(lái)更好的判斷細(xì)胞的功能和活性。除此之外，表面蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)可以幫助細(xì)胞分類，提高細(xì)胞類型識(shí)別準(zhǔn)確度。
CITE-seq一次可以測(cè)多少種抗體？
理論上來(lái)說(shuō)使用的抗體種類數(shù)量是沒(méi)有上限的。數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)流式細(xì)胞儀的熒光團(tuán)數(shù)量或質(zhì)譜儀的同位素?cái)?shù)量。但是要考慮到抗體太多導(dǎo)致費(fèi)用更多等其他問(wèn)題。目前CITE-seq常見的檢測(cè)蛋白數(shù)量是100-200個(gè)左右。
示例文獻(xiàn)
這篇文獻(xiàn)中，同時(shí)使用了scRNA-seq, CITE-seq和空間轉(zhuǎn)錄組。這里我們只關(guān)注CITE-seq的部分：
看下方法學(xué)：
這篇文章只對(duì)26個(gè)樣本中的4個(gè)樣本進(jìn)行了CITE-seq測(cè)序，檢測(cè)了157個(gè)細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)。但是后續(xù)使用了Seurat的anchoring-based transfer learning算法用4個(gè)樣本的CITE-seq值計(jì)算出所有剩余沒(méi)有進(jìn)行CITE-seq的樣本對(duì)應(yīng)膜蛋白的表達(dá)值。
下期預(yù)告
- 示例文獻(xiàn)解讀以及結(jié)果復(fù)現(xiàn)
- scCITE-seq測(cè)序數(shù)據(jù)分析：CITE-seq-Count
- scCITE-seq數(shù)據(jù)下游分析：Seurat
Reference
[1]http://www.itdecent.cn/p/442d890d12ea
[2]https://www.bilibili.com/video/av328984786/?vd_source=0678d16c91cefd3d36645d90da8ed188
[3]Nam, A. S., Chaligne, R., & Landau, D. A. (2021). Integrating genetic and non-genetic determinants of cancer evolution by single-cell multi-omics. Nature reviews. Genetics, 22(1), 3–18. https://doi.org/10.1038/s41576-020-0265-5
[4]Kashima, Y., Sakamoto, Y., Kaneko, K. et al. Single-cell sequencing techniques from individual to multiomics analyses. Exp Mol Med52, 1419–1427 (2020). https://doi.org/10.1038/s12276-020-00499-2
[5]Reimeg?rd, J., Tarbier, M., Danielsson, M. et al. A combined approach for single-cell mRNA and intracellular protein expression analysis. Commun Biol**4, **624 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02142-w
[7]Wu, S.Z., Al-Eryani, G., Roden, D.L. et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet**53, **1334–1347 (2021). https://doi.org/10.1038/s41588-021-00911-1
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