前言
我在2019年3月份寫過(guò)一篇這樣的文章（一文讀懂scRNA-Seq）到底要花多久時(shí)間才能看懂一套單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果？，并在文末許諾，對(duì)PPT感興趣的小伙伴可以留言詢要PPT。沒想到后來(lái)有陸陸續(xù)續(xù)超過(guò)幾十個(gè)人留下了郵箱，這時(shí)候發(fā)現(xiàn)事情大條了。那篇文章是我第一次認(rèn)真看的單細(xì)胞文章，可以說(shuō)是什么都不懂，因此看了有超過(guò)十個(gè)小時(shí)，看的時(shí)候還查專業(yè)詞匯和背景知識(shí)，可見那一文必然非常青澀。時(shí)常覺得自己對(duì)不起這幾十個(gè)讀者的信任，非常擔(dān)心自己并沒有提供什么好的學(xué)習(xí)經(jīng)驗(yàn)，因此早早打定主意說(shuō)要重新寫一篇，讓大家看到單細(xì)胞的文章其實(shí)也并非那么簡(jiǎn)單，體會(huì)到單細(xì)胞的美。
這里仍然會(huì)按照之前提到的看文獻(xiàn)方法：老板親自傳授的文獻(xiàn)閱讀方法來(lái)準(zhǔn)備這篇文獻(xiàn)解讀。廢話不多說(shuō)，開始吧。
選文
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-14777-0
文章標(biāo)題囊括了三個(gè)熱點(diǎn)：tracing tumorigenesis，tumor model，single-cell resolution
1. tumorigenesis：腫瘤發(fā)生是一個(gè)非常細(xì)微且難以察覺的事件，其具體進(jìn)程如下圖所示。腫瘤的發(fā)生非常難以檢測(cè)，并且缺少臨床樣本。因此，tracing tumorigenesis 還有許多未知且絕對(duì)是腫瘤學(xué)的熱點(diǎn)之一。
2. tumor model：腫瘤的研究離不開好的模型。目前我們知道的腫瘤研究模型有：腫瘤細(xì)胞系，原代細(xì)胞系，CDX，PDX，基因工程小鼠，包括最近大火的organoid等等。這些研究模型各有利弊，PDX和基因工程小鼠，其中某些基因工程小鼠的表現(xiàn)十分優(yōu)異，例如鄧初夏教授培育的：Brca1 ?ox/?ox ; MMTV-Cre mice （帶有Brca1 exon11的缺失，可自發(fā)形成乳腺癌）。那么這篇文章其實(shí)是基于作者團(tuán)隊(duì)的前期研究結(jié)果來(lái)進(jìn)行的，他們?cè)谇捌诘臅r(shí)候構(gòu)建了 K14-cre-β-catGOF Bmpr1aLOF mice （gain of function of β-catenin; loss of function of Bmpr1a ），這種小鼠可以自發(fā)發(fā)生特異性的 salivary gland head and neck squamous cell carcinomas (SCCs)，即唾液腺頭頸部鱗癌。擁有這樣的腫瘤模型小鼠，他們?cè)谧约旱念I(lǐng)域上就沒有人可以跟上了。
3. single-cell resolution：無(wú)需多做解釋
再次提一下我看文的思路：
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1. Background and gap
常規(guī)套路：（1）某某癌癥是非常嚴(yán)重的疾??；（2）某某基因、蛋白在這個(gè)癌癥中起很大的作用，But，它在某個(gè)過(guò)程中的作用尚未明確；（3）某某過(guò)程是在腫瘤發(fā)生中非常關(guān)鍵，But，我們目前對(duì)它還知之甚少。。。。。。
本文提到：腫瘤發(fā)生過(guò)程是對(duì)腫瘤治療研究的非常重要的一步，但是目前我們對(duì)腫瘤發(fā)生這個(gè)起點(diǎn)知道的太少了。雖然patient samples可提供巨量的信息，But，由于腫瘤樣本的異質(zhì)性以及疾病的復(fù)雜性，樣本常常是混雜的多期腫瘤細(xì)胞，并已丟失tumorigenesis階段的信息，因此，合理的tumor model和對(duì)照十分重要。正好作者的前期研究發(fā)現(xiàn)：某基因、信號(hào)通路對(duì)salivary gland SSCs的發(fā)生起非常重要的作用，并創(chuàng)建了相應(yīng)的腫瘤模型，因此打算來(lái)個(gè)高精度的研究，探一探這腫瘤發(fā)生的究竟
2. Aims, Novelty/Significance
略
3. Hypothesis
hypothesis高度濃縮了預(yù)期的結(jié)果，要求不僅僅看摘要，還要了解introduction。Introduction是文章中非常寶貴的一段，這是作者思路的集中體現(xiàn)，同時(shí)我們也可以通過(guò)認(rèn)真閱讀來(lái)快速了解作者這一領(lǐng)域的大致情況。這比自己瘋狂找十篇文章來(lái)看要高效得多。當(dāng)然有時(shí)候別人引用文獻(xiàn)只是提及其中小小一點(diǎn)，不能代替被引文獻(xiàn)的全貌，因此只能說(shuō)是大致了解用，真正要了解還得下苦功。
Hypothesis：
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4. Major approaches
重要的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、材料、方法非常重要，不然無(wú)法理解文章結(jié)果從何而來(lái)，這邊我一般是先一掃而過(guò)method，然后再結(jié)合結(jié)果來(lái)看那些我無(wú)法理解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
文中method：
1. Mouse strains：介紹小鼠的基本情況，以及雜交培育設(shè)計(jì)，略。
2. Tissue dissociation and single-cell sample preparation
收集頜下腺及原發(fā)腫瘤標(biāo)本，置于（DMEM/F12 1:1）、膠原酶1.67 mg/ml (Invitrogen)、透明質(zhì)酸酶1.33 mg/ml (Sigma)、祛除酶1.67 mg/ml (Invitrogen)中，并用 GentleMacs Dissociator (Miltenyi Biotec) 儀器將其粉碎、解離。細(xì)胞懸浮液過(guò)70 μm篩，900 g×5 min，4°C離心。小碎塊用10ml （DMEM/F12 1:1）重懸，10%FBS的PBS洗滌三次。DAPI染色后過(guò)40μm篩網(wǎng)。使用FACS對(duì)死亡細(xì)胞進(jìn)行分選，去除DAPI陽(yáng)性細(xì)胞（死細(xì)胞）。分選出的活細(xì)胞固定在冰冷的80%甲醇中，- 80°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
3. Drop-seq procedure, single-cell and bulk library generation, and sequencing
4. CITE-seq experiments
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可見CITE-seq是依賴已有抗體，對(duì)特定細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序的方法，順便了解REAP-seq：了不得了，同時(shí)測(cè)RNA和蛋白
了不得了，同時(shí)測(cè)RNA和蛋白
5. Immunostainings
6. Processing and analysis of single-cell RNA-seq data，生信工程師上場(chǎng)，原文寫得非常非常詳細(xì)。
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5. Major results （重頭戲）
框架：
(1) Single-cell RNA sequencing of salivary gland tumors.
(2) A comprehensive salivary gland cell atlas.
(3) Identi?cation of cancer stem cells and other tumor-speci?c cell populations.
(4) Simultaneous quanti?cation of mRNA and cell surface proteins resolves immune cell diversity.
(5) Subclustering reveals two subpopulations of cancer stem and basal cells.
(6) Computational lineage analyses reconstruct tumorigenesis.
(1) Single-cell RNA sequencing of salivary gland tumors.
這部分涉及到樣本準(zhǔn)備的方法，還有測(cè)序數(shù)據(jù)的基本情況。主要目的是：證明樣本、數(shù)據(jù)質(zhì)量合格。這里的標(biāo)準(zhǔn)是：1)single-cell 測(cè)序數(shù)據(jù)要和bulk-seq數(shù)據(jù)的相關(guān)性高（相關(guān)性分析）；2)測(cè)序深度，測(cè)序數(shù)據(jù)量要夠（過(guò)濾后查看genes和UMI數(shù)量）；3)為避免批次效應(yīng)，作者使用基于熵的測(cè)量方法來(lái)測(cè)定：細(xì)胞最近鄰在不同樣本中的分布有多均勻 (To quantify sample-to-sample variation and the extent of possible batch effects, we developed an entropy-based approach to measure how evenly cells nearest neighbors are distributed among different samples)。
Protocol procedure（如下圖）
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1)single-cell 測(cè)序數(shù)據(jù)要和bulk-seq數(shù)據(jù)的相關(guān)性高（相關(guān)性分析）；2)測(cè)序深度；
image.png可見單細(xì)胞測(cè)序和bulk的相關(guān)性高，并且測(cè)序深度，數(shù)據(jù)量都挺好的（如上圖）。
3）數(shù)據(jù)均勻度
image.png分析表明，雖然這些分布不完全是隨機(jī)的，但80%的變異是由三個(gè)主要的生物變量(基因型、性別和階段)引起的（如上圖）。
image.png此外，除了受這些生物變量之一影響的細(xì)胞類型外，細(xì)胞分布基本上是平衡的（如上圖）
總結(jié)，1）單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)和bulk相關(guān)性高，說(shuō)明單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)可以代表樣本的情況，證明方法科學(xué)可靠；2）通過(guò)過(guò)濾后，得到足夠多的具有一定測(cè)序深度的細(xì)胞數(shù)以及UMI，說(shuō)明測(cè)序過(guò)程良好，數(shù)據(jù)量夠，證明數(shù)據(jù)可靠；3）通過(guò)數(shù)據(jù)處理，消除批次效應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，有性別，基因型以及疾病等級(jí)會(huì)一定程度上影響細(xì)胞的均勻程度，但這恰恰是真實(shí)情況，描述即可。大的單細(xì)胞文章都會(huì)把這部分放在補(bǔ)充材料中，這篇文章也不例外。
(2) A comprehensive salivary gland cell atlas.
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為了提供一個(gè)全面的唾液腺細(xì)胞圖譜，也可以作為一個(gè)適當(dāng)?shù)膮⒖寄[瘤的背景，作者對(duì)control組（唾液腺）的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行了cluster，并根據(jù)已報(bào)道的marker來(lái)定義每一個(gè)細(xì)胞簇（上圖b）。同樣他們也發(fā)現(xiàn)了一些性別依賴的marker，以及不同細(xì)胞的marker，這些數(shù)據(jù)放在了補(bǔ)充材料中。之后進(jìn)行免疫熒光染色，確定不同細(xì)胞和表達(dá)不同的marker（下圖b），并根據(jù)這些結(jié)果并繪制出解剖結(jié)構(gòu)圖 （上圖c）。作者還發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的變化，細(xì)胞proportion也會(huì)隨之變化（補(bǔ)充材料）
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小結(jié)：這些結(jié)果提供了cluster結(jié)果，這是常規(guī)做法，亮點(diǎn)在于解剖結(jié)構(gòu)圖的繪制，且解剖結(jié)構(gòu)圖還經(jīng)過(guò)免疫熒光染色驗(yàn)證（如果能有連續(xù)切片的HE染色結(jié)果則數(shù)據(jù)完整性和說(shuō)服力更好）。
(3) Identi?cation of cancer stem cells and other tumor-speci?c cell populations.
注意，本文亮點(diǎn)。作者將control組和double mutant (DM) 的單細(xì)胞數(shù)據(jù)都放在一起，原樣又做了一次cluster，誒，發(fā)現(xiàn)有一群細(xì)胞是在tumor中特有的。發(fā)現(xiàn)，在腫瘤環(huán)境中具有獨(dú)特轉(zhuǎn)錄特征的上皮細(xì)胞簇，包括管腔樣細(xì)胞和基底樣細(xì)胞，以及小而獨(dú)特的癌癥干細(xì)胞(CSC)樣群，其中Wnt特異性基因被激活（如下圖）。并發(fā)現(xiàn)少數(shù)基因是在tumor-specific族群中是特異表達(dá)的。
control+DM
利用在單細(xì)胞數(shù)據(jù)挖掘中得到的marker，使用免疫熒光驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，這些高表達(dá)細(xì)胞確實(shí)在腫瘤中出現(xiàn)，可以證明這些gene是tumor-specific的（如下圖）。在這里，作者可以明確，他們提出了一個(gè)tumor-specific的gene set。
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小結(jié)：做單細(xì)胞cluster誰(shuí)都會(huì)，但是結(jié)合細(xì)胞的實(shí)際空間位置去尋找特異細(xì)胞簇是非常聰明的做法，有免疫熒光的結(jié)果驗(yàn)證gene set，使得gene set不僅僅是RNA水平，同時(shí)上升到了蛋白水平，更具說(shuō)服力。
(4) Simultaneous quanti?cation of mRNA and cell surface proteins resolves immune cell diversity.
在做cluster分析的時(shí)候，作者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了immune，basal細(xì)胞簇是在DM組中比例大，且acinar在control中比例大（如下圖），引起作者的注意，并往immune cell這方面繼續(xù)挖掘。
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對(duì)于可以固定住的細(xì)胞，做免疫熒光是可行的方法，但是對(duì)于免疫細(xì)胞則相對(duì)困難，在這里作者想到了CITE-seq（參照上面介紹）
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發(fā)現(xiàn)：CITE-seq的結(jié)果和scRNA-seq的結(jié)果確實(shí)是重疊的，再一次從蛋白水平驗(yàn)證了scRNA-seq的結(jié)果，同時(shí)還計(jì)算了immune cell proportion的變化，證實(shí)DM組中的免疫細(xì)胞數(shù)量都高于control組，說(shuō)明腫瘤周邊的免疫細(xì)胞更多，免疫微環(huán)境處于激活狀態(tài)（如下圖）。提示TAMs是廣泛而連續(xù)的功能狀態(tài)和分化狀態(tài)，而不是一個(gè)明確的極化腫瘤支持與腫瘤抑制模型 。
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小結(jié)：多組學(xué)結(jié)合之CITE-seq
(5) Subclustering reveals two subpopulations of cancer stem and basal cells.
將某個(gè)特地細(xì)胞群做subclustering也是常規(guī)操作。根據(jù)先前的結(jié)果，有一群tumor-specific的細(xì)胞，是非常適合拿來(lái)再分析的（如下圖）。
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通過(guò)subclustering，作者分出了CSC1 CSC2兩個(gè)群體，并且發(fā)現(xiàn)了它們特異的gene-set（如下圖1）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)basal tumor相較于normal，basal tumor具有EMT和matrisome的gene表達(dá)特征，并用熒光染色驗(yàn)證EMT是早期basal tumorigenesis的特征（如下圖 supplementary figure 10）。
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小結(jié)：根據(jù)前期研究結(jié)果，將proportion異常的細(xì)胞群拿來(lái)再cluster是常規(guī)操作，使用免疫熒光驗(yàn)證gene set則是不易。
(6) Computational lineage analyses reconstruct tumorigenesis. 人見人愛的大總結(jié)
image.png人見人愛擬時(shí)序分析
image.png人見人愛熱圖+聚類
總結(jié)：basal細(xì)胞在分化為luminal-like細(xì)胞之前，在β-catenin激活和Bmpr1a功能喪失的情況下，腫瘤的發(fā)生由EMT的信號(hào)啟動(dòng)，并表現(xiàn)為Wnt差異信號(hào)驅(qū)動(dòng)的CSC細(xì)胞的異質(zhì)性（如下圖所示）。
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6. Pitfuls & alternative approaches/remaining questions: 略
結(jié)語(yǔ)
這篇文章第一次粗略看+做5頁(yè)內(nèi)PPT大花費(fèi)3小時(shí)。這次是第二次看，邊看邊整理出這篇文章，花費(fèi)約7個(gè)半小時(shí)。收獲很大，第二次看比第一次更細(xì)，且終于可以理解文章的大部分細(xì)節(jié)和思路，這對(duì)我們來(lái)說(shuō)是最重要的。精讀對(duì)了解一個(gè)陌生領(lǐng)域非常重要。
