這周二組會(huì)期間。導(dǎo)師提起要將實(shí)驗(yàn)室所有構(gòu)建的載體在Geneious里面統(tǒng)一管理。然后順便問了一句是不是大家都會(huì)使用Geneious進(jìn)行載體構(gòu)建。然后提了一句，總不會(huì)有人的載體圖譜是靠復(fù)制黏貼繪制的吧。我想說我就是那個(gè)不會(huì)操作的人，突然間發(fā)現(xiàn)自己就是拿著屠龍寶刀當(dāng)砍柴刀用-暴殄天物??！

作為一個(gè)老博士生，分子生物學(xué)最基礎(chǔ)的載體構(gòu)建都不會(huì)就有點(diǎn)說不過去了。于是我花了半天時(shí)間來摸索如何使用Geneious模擬實(shí)驗(yàn)條件下的載體構(gòu)建。終于搞得七七八八了。廢話少說，上菜！

這里我想將水稻OsNHX4連接到1300 35S-NeGFP載體NeGFP的后面。

待連接的片段及載體

我們知道對(duì)于融合蛋白載體的構(gòu)建，主要是需要保證基因不能發(fā)生移碼突變。我們查看載體，發(fā)現(xiàn)緊鄰eGFP的Sac I 可以將載體進(jìn)行線性化（整個(gè)載體中，Sac I 只有這一個(gè)酶切位點(diǎn)）。步驟是：>點(diǎn)擊Cloning >Digest into fragments

Sac I將目標(biāo)載體線性化

將載體線性化后，我們總共得到三個(gè)文件，當(dāng)選中被線性化的載體序列放大后，我們能看到線性化載體的兩端都有一個(gè)Sac I酶切后形成的overhang

Sac I 線性化載體形成overhang

由于在重組過程中，5‘-外切酶會(huì)將載體的粘性末端切除，為了好設(shè)計(jì)引物，在這里，我們需要重新把將要被切除的序列重新添加到Sac I前面并注釋好。由于Sac I識(shí)別的位點(diǎn)是GAGCTC,而在載體上還存在一個(gè)G,因此我們需要補(bǔ)齊后面的5個(gè)堿基AGCTC，并保存好。

在Sac I overhang前面補(bǔ)齊AGACTC

接下來，選中目的基因及修改好的線性化的載體，并依次點(diǎn)擊cloning ,再選擇Gibson assembly

點(diǎn)擊Gibson assembly之后，我們可以看到下面的界面，在這里需要設(shè)計(jì)兩個(gè)地方：第一個(gè)是選擇Backbone,即選擇線性化的載體作為Backbone。其次需要將外切酶選為5‘-外切酶，然后再確定。

最后，重組載體就構(gòu)建好了，并且會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的重組載體，PCR擴(kuò)增的引物以及一份報(bào)告。到這就大功告成了。點(diǎn)擊重組的載體，你會(huì)發(fā)現(xiàn)這與你實(shí)際試驗(yàn)應(yīng)該是吻合的。