文章概覽

題目：Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq

中文題目：通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析IDH突變型膠質(zhì)瘤的遺傳、譜系和微環(huán)境特征

第一作者：Andrew S. Venteicher, Itay Tirosh

通訊作者：Aviv Regev, Mario L. Suvà

日期：2017.3.31

被引次數(shù)：436

期刊：Science

影響因子：41.845

引言

在成人中，根據(jù)綜合遺傳和組織學(xué)參數(shù)將彌漫性膠質(zhì)瘤分為三大類：IDH-野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM) 是該疾病最普遍和最具侵襲性的形式，而IDH1（或較少見的IDH2?) 突變包含了兩大類神經(jīng)膠質(zhì)瘤：星形細(xì)胞瘤 (IDH-A) 和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤 (IDH-O) 。IDH-A 和 IDH-O 是兩種不同的腫瘤類型，它們的遺傳、組織病理學(xué)和預(yù)后上有所不同。

從遺傳上講，IDH-A 的特征是TP53和ATRX突變，而 IDH-O 的特征是TERT啟動(dòng)子突變和染色體臂 1p 和 19q 丟失。在組織病理學(xué)中，IDH-A 和 IDH-O 也是不同的，被認(rèn)為主要分別概括了星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化譜系。少突膠質(zhì)細(xì)胞（例如，OLIG2）和星形膠質(zhì)細(xì)胞（例如，膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (GFAP)）標(biāo)志物的表達(dá)在這兩種疾病中都可以很容易地識(shí)別，但在單個(gè)腫瘤中，具有腫瘤性星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的組織學(xué)特征細(xì)胞混合物經(jīng)常出現(xiàn)。因此，這兩種不同膠質(zhì)瘤獨(dú)立遵循神經(jīng)膠質(zhì)譜系的假設(shè)是有問題的。

在這里，作者將 10 個(gè) IDH-A 神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本的 9879 個(gè)細(xì)胞（經(jīng)過質(zhì)控后保留了 6341 個(gè)單細(xì)胞）和 6 個(gè) IDH-O 神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本的 4347 個(gè)細(xì)胞（先前的研究）的scRNA-seq和 165 個(gè) TCGA bulk RNA-seq相結(jié)合，以破譯癌細(xì)胞基因型和表型，并深入了解 IDH-突變膠質(zhì)瘤。樣本信息如下。

樣本信息

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IDH-A 和 IDH-O 之間的差異主要是由特定的遺傳事件和不同的TME組成來解釋的，而不是由兩種腫瘤類型的惡性細(xì)胞中神經(jīng)膠質(zhì)譜系的不同影響來解釋的。此外，隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級(jí)的增加，我們觀察到惡性細(xì)胞增殖增強(qiáng)、未分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞池增多，以及 TME 中巨噬細(xì)胞相對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞程序的增加。

本文的研究思路如下：

圖1 研究思路

使用scRNA-seq 破解 IDH 突變膠質(zhì)瘤樣本之間的差異

為了區(qū)分惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞，作者使用了層次聚類和CNV結(jié)合判斷的方法，通過基因表達(dá)的層次聚類可以將細(xì)胞分成三組：腫瘤細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。通過CNV的預(yù)測(cè)可以驗(yàn)證惡性細(xì)胞判斷的準(zhǔn)確性。WES和FISH驗(yàn)證了CNV的結(jié)果。使用這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，識(shí)別 5097 個(gè)惡性細(xì)胞。

圖2 細(xì)胞分類

Bulk IDH-A 和 IDH-O 膠質(zhì)瘤樣本間的許多差異并非源于惡性細(xì)胞

作者首先使用來自 TCGA 數(shù)據(jù)集的76 個(gè) IDH-O 和 91 個(gè) IDH-A 膠質(zhì)瘤的bulk RNA-seq表達(dá)譜進(jìn)行了差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了約 550 個(gè)差異表達(dá)的基因，表明存在不同的調(diào)控程序。但因?yàn)樗砹藰颖镜钠骄?，因此作者又進(jìn)行了惡性細(xì)胞單細(xì)胞的差異表達(dá)分析。但發(fā)現(xiàn)bulk RNA-seq中差異表達(dá)的基因只有大約一半存在于惡性細(xì)胞單細(xì)胞的差異表達(dá)基因中，說明其他的差異來源于小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞marker基因和神經(jīng)元marker基因。與 IDH-O 腫瘤相比，IDH-A 腫瘤具有更多的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和更少的神經(jīng)元。

圖3 IDH-A 和 IDH-O 的差異表達(dá)

IDH-A 和 IDH-O 惡性細(xì)胞間的表達(dá)差異大多來源于遺傳因素

特定的遺傳事件決定了兩種膠質(zhì)瘤的一些差異。比如在 IDH-A 中，惡性細(xì)胞中具有較高表達(dá)的大多數(shù)基因位于染色體 1p 和 19q 上，然而它們?cè)?IDH-O 中是缺失的。CIC基因功能的缺失在IDH-O中具有大約10%的差異，作者還發(fā)現(xiàn)p53突變?cè)趦烧咧幸财鸷艽笞饔谩?/p>

scRNA-seq 揭示了 IDH-A 和 IDH-O 中共享的神經(jīng)膠質(zhì)譜系

IDH-A 和 IDH-O 被認(rèn)為主要分別概括了星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系。但是上述結(jié)果表明 IDH-A 和 IDH-O 之間的大部分差異可能是由遺傳因素和 TME 引起的，不符合這些腫瘤有著不同神經(jīng)膠質(zhì)譜系的假設(shè)。事實(shí)上，作者觀察到 IDH-A 和 IDH-O 之間AC的marker基因和OC的marker基因的差異表達(dá)有限（圖4A）。相反，這些基因的表達(dá)在 IDH-A 和 IDH-O 腫瘤中的每一個(gè)細(xì)胞中有很大差異。減去瘤間差異后，所有 IDH-A 細(xì)胞的主成分分析 (PCA) 表明主成分 PC1 和 PC2 與星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性 (PC1/2-high) 和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性 (PC1/2-low) 基因相關(guān)（圖4B）

圖4?

為了更精確地分類腫瘤細(xì)胞，作者定義了膠質(zhì)細(xì)胞譜系基因來區(qū)分AC-like和OC-like細(xì)胞。這些表達(dá)程序使用另外經(jīng)過10X Genomics測(cè)序的3538個(gè)IDH-A細(xì)胞產(chǎn)生，并且也在IDH-O的細(xì)胞中表達(dá)（圖5）。經(jīng)過對(duì)每種腫瘤中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行這些程序的表達(dá)評(píng)分，然后使用這些分?jǐn)?shù)對(duì)每個(gè)程序的優(yōu)先表達(dá)以及中間細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行分類（圖5C）?？梢钥吹剿心[瘤都表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞狀態(tài)分布，但?IDH-A 的中間狀態(tài)細(xì)胞更多。IDH野生型GBM的細(xì)胞類型分布與IDH突變型膠質(zhì)瘤也非常不同，GBM顯示出最高的Astro程序偏好性（圖5B）。

圖5

作者接下來研究IDH-A 和 IDH-O 惡性細(xì)胞之間差異表達(dá)的 192 個(gè)基因是否在所有惡性細(xì)胞中共同存在，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可歸因于標(biāo)志性遺傳改變的 109 個(gè)基因的表達(dá)差異在所有惡性細(xì)胞中共享。然而，IDH-A 和 IDH-O 在其余 83 個(gè)差異基因的表達(dá)在已分化的腫瘤細(xì)胞中差異最明顯，而在大多數(shù)未分化的癌細(xì)胞中幾乎完全消失（也就是說未分化的細(xì)胞差異并不大），這也說明了?IDH-A 和 IDH-O 有著共同的細(xì)胞起源的可能性。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)，我們分析了?整體的?DNA甲基化模式，因?yàn)?DNA 甲基化數(shù)據(jù)會(huì)保留基因表達(dá)差異不明顯的起始細(xì)胞的表觀遺傳特征。作者發(fā)現(xiàn)，IDH-A 和 IDH-O 之間的 DNA 甲基化高度相似，盡管 DNA 甲基化受IDH突變的影響很大。

未分化的腫瘤細(xì)胞與“增殖”程序和共享的“干性”程序有關(guān)

在 IDH-A 和 IDH-O 中，只有一小部分細(xì)胞在增殖，而且增殖和分化之間負(fù)相關(guān)，增殖和干性之間正相關(guān)（圖6A）。作者將推定的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞程序定義為在 IDH-A 和 IDH-O 的未分化細(xì)胞中富集和共表達(dá)的基因子集（圖6C）。該程序包括神經(jīng)發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子（例如 SOX4、SOX11 和 TCF4），并且與人類神經(jīng)干細(xì)胞 (NSC) 和神經(jīng)祖細(xì)胞 (NPC) 的表達(dá)程序一致，還與之前在 IDH-O 研究中的程序一致。

染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AC和OC譜系的marker（APOE和APOD）互斥表達(dá)；AC譜系和“增殖”的marker（APOE和Ki67）互斥表達(dá)；“增殖”和“干性/祖細(xì)胞”的marker（Ki67和SOX9）共表達(dá)（圖6C）。

圖6

與腫瘤分級(jí)和遺傳亞克隆相關(guān)的腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異

盡管 IDH-A 和 IDH-O 共享相同的干/祖細(xì)胞程序和假定的神經(jīng)膠質(zhì)分化譜系，但還是可以在組織中觀察到區(qū)域和腫瘤間的異質(zhì)性。IDH-A和IDH-O腫瘤的比較揭示三個(gè)主要區(qū)別：（1）IDH-A中cycling細(xì)胞的總體比例更高；（2）IDH-A中未分化細(xì)胞的總體比例更高；（3）在IDH-O中，同一個(gè)細(xì)胞中AC和OC譜系的評(píng)分負(fù)相關(guān)（這與膠質(zhì)發(fā)生中一個(gè)譜系會(huì)抑制另一個(gè)譜系的特征相一致），但這種特征在IDH-A中沒有被觀察到。

IDH-A 在三個(gè)方面都存在與腫瘤分級(jí)相關(guān)的顯著差異，較高級(jí)別的腫瘤往往具有更多的cycling細(xì)胞、更多的未分化細(xì)胞以及AC和OC譜系程序之間更有限的聯(lián)系（圖7A）。通過對(duì)大量 TCGA 樣本的分析驗(yàn)證了循環(huán)惡性細(xì)胞的比例與腫瘤等級(jí)之間的相關(guān)性。

與腫瘤分級(jí)相關(guān)的特征可能也會(huì)在同一腫瘤的不同亞克隆中存在，圖7B和7C顯示了不同亞克隆的分化模式和cycling細(xì)胞比例的不同。

圖7

總體來說，這些結(jié)果都表明分化和增殖的模式部分收到遺傳因素的影響。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步探究遺傳進(jìn)化對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)有哪些具體影響。

膠質(zhì)瘤 TME 中的小膠質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的平衡

作者最后使用 PCA 來分析小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的多樣性，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是 TME 中非惡性細(xì)胞的主要子集（IDH-A,?n?= 1043，IDH-O,?n?= 246）。PC2反映了由細(xì)胞因子（白介素IL-1，IL-8，腫瘤壞死因子TNF）、趨化因子 (CCL3 和 CCL4)、NF-κB 相關(guān)基因（REL、NFKBIA 和 NFKBIZ）和即刻早期基因（JUNB、FOSB、EGR3、IER3 和 ATF3）組成的炎癥程序。該程序在 IDH-A 和 IDH-O 腫瘤中的大多數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中都很活躍，并且類似于 IDH-O 中報(bào)道的程序。

即刻早期基因（Immediate early genes ， IEGs）細(xì)胞經(jīng)外部刺激后最先表達(dá)的一組基因，是聯(lián)系細(xì)胞生化改變與細(xì)胞最終對(duì)刺激發(fā)生特異性反應(yīng)的中介物。不僅參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化過程，而且也參與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞過程和細(xì)胞的能量代謝過程，在學(xué)習(xí)記憶中起著極為重要的作用。IEGs不同于“晚期反應(yīng)”基因，后者只有在早期反應(yīng)基因產(chǎn)物合成后才會(huì)被激活。因此，IEGs被稱為“通往基因組反應(yīng)的門戶”。這些基因的激活不需要蛋白質(zhì)的從頭合成。代表基因有Fos, Zif268, Arc, Homer1a等。 這些基因中的一些產(chǎn)物能夠把細(xì)胞從靜止的G0期喚醒，從而進(jìn)入活躍期。

PC1 突出了兩個(gè)相互對(duì)立的程序，它們與小膠質(zhì)細(xì)胞 (PC1-high) 和巨噬細(xì)胞 (PC1-low) 表達(dá)程序高度一致（圖8A）。高 PC1 基因包括小膠質(zhì)細(xì)胞marker，例如 CX3CR1、P2RY12 和 P2RY13。而 CD163、TGFBI 和 F13A1 屬于低 PC1 基因，并且在不同巨噬細(xì)胞群中的表達(dá)高于小膠質(zhì)細(xì)胞。因此，PC1-high 和 PC1-low 之間的差異可能對(duì)應(yīng)于大腦駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞與通過血腦屏障滲透到達(dá)腫瘤的浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞的不同。

通過小膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因與巨噬細(xì)胞特異性基因的相對(duì)表達(dá)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分顯示出連續(xù)的分布而不是雙峰分布（圖8B）。因此小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間沒有明顯的分界線。圖8C顯示了膠質(zhì)瘤的巨噬細(xì)胞與黑色素瘤的腫瘤巨噬細(xì)胞（頂部）的巨大差異。因此，膠質(zhì)瘤微環(huán)境可能改變了巨噬細(xì)胞的表達(dá)譜，從而減少了它們與小膠質(zhì)細(xì)胞的差異。此外，來自每個(gè)個(gè)體腫瘤的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的評(píng)分范圍有限，一些腫瘤偏向于巨噬細(xì)胞-like細(xì)胞，（例如 MGH42），而其他腫瘤偏向于小膠質(zhì)細(xì)胞-like細(xì)胞（例如 MGH56）（圖8C）。這些表明不同腫瘤的微環(huán)境的特征由免疫細(xì)胞的不同起源決定。

圖8

總之，更高級(jí)別的膠質(zhì)瘤對(duì)應(yīng)著更高的比例的巨噬細(xì)胞?？紤]到血管生成也是更高級(jí)別膠質(zhì)瘤的特征之一，作者發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞（血管）的基因表達(dá)和巨噬細(xì)胞而非小膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)相關(guān)（圖8D, E）。最后，作者通過對(duì) CX3CR1（小膠質(zhì)細(xì)胞）和 CD163（巨噬細(xì)胞）進(jìn)行 RNA 原位雜交驗(yàn)證了我們的觀察結(jié)果（圖8F），結(jié)果表明MGH56含有更多小膠質(zhì)細(xì)胞，而沒有巨噬細(xì)胞，MGH43中小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的marker都表達(dá)，MGH42只有巨噬細(xì)胞的marker。最后，與 IDH-O 相比，IDH-A 中小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)總體增加。

盡管內(nèi)皮細(xì)胞的程序與巨噬細(xì)胞的表達(dá)程序相關(guān)，但并不能完全解釋小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞總體比例的變異性。為了尋找與TAM豐度相關(guān)的因素，作者在bulk中腫瘤數(shù)據(jù)中尋找了到了24個(gè)在TAM中不表達(dá)但與TAM豐度相關(guān)的基因，該表達(dá)程序可以較好的預(yù)測(cè)TAM的浸潤(rùn)程度和腫瘤類型，但依然不能確定是否存在因果關(guān)系。有趣的是，其中三個(gè)基因是補(bǔ)體系統(tǒng)的組成部分，這與在黑色素瘤中成纖維細(xì)胞 - 免疫細(xì)胞相互作用的類似分析中所觀察到的類似。

本文提到的marker基因

OC:?MBP, MOBP, PLLP, ?CLDN11

OC lineage:?OLIG2, APOD

AC: GFAP

AC lineage: APOE

Proliferation: MKI67

Stem/progenitor:?SOX4

Microglia:?CX3CR1, P2RY12, P2RY13

Macrophage:?CD163, TGFBI, F13A1

本文的附錄S3（aai8478-table-s3.xlsx）列舉了腫瘤細(xì)胞的marker

參考

https://science.sciencemag.org/content/355/6332/eaai8478