10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組的初探索

編輯：陸瑤

校對(duì)：ANIMUS

編者按：腦科學(xué)是最迷人的學(xué)科之一，也是最可能取得重大突破的學(xué)科，一直是全世界科學(xué)研究熱點(diǎn)。隨著8月29日埃隆·馬斯克(Elon Musk)的腦機(jī)接口公司Neuralink直播展示了最新芯片植入豬腦后可探測(cè)小豬神經(jīng)元的活動(dòng)，讀取腦部活動(dòng)，未來(lái)可幫助解決許多神經(jīng)系統(tǒng)問(wèn)題，比如記憶力減退、中風(fēng)、成癮等，再一次掀起了全世界對(duì)腦科學(xué)研究熱潮。而目前對(duì)大腦各功能區(qū)依然所知甚少，從分子水平理解其結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于腦重大疾病的防治具有重大戰(zhàn)略意義。

愛(ài)麗慕斯學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)專注于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)前沿進(jìn)展，探索心腦血管疾病和癌癥的致病基因、發(fā)病機(jī)制和藥物開發(fā)等，尤其是腦科學(xué)。作為本刊【Amazing brain】系列第一篇，這里解讀全球首篇應(yīng)用10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組研究人腦前額葉背外側(cè)皮質(zhì)的空間基因表達(dá)譜的文章，助力腦科學(xué)前沿進(jìn)展共享。

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腦組織功能與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。其中大腦皮層具有經(jīng)典的分層結(jié)構(gòu)（L1~L6），不同層之間細(xì)胞表現(xiàn)出差異的基因表達(dá)模式，因而具有不同的形態(tài)、生理學(xué)和連接模式。而某些神經(jīng)精神疾病也與特定皮層的基因表達(dá)、突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)。因此，在細(xì)胞分辨率下定位人腦中的空間基因表達(dá)對(duì)于深入了解疾病機(jī)制至關(guān)重要。但目前廣泛運(yùn)用的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，由于解離組織成單個(gè)細(xì)胞而丟失了組織中細(xì)胞的空間位置信息。而空間轉(zhuǎn)錄組作為一種近年來(lái)新興的技術(shù)，可在組織切片上原位捕獲RNA，并進(jìn)行cDNA合成和測(cè)序，得到樣本較為完整的基因表達(dá)空間圖譜。

2020年2月28日，約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院利伯腦發(fā)育研究所的Keri Martinowich和約翰霍普金斯彭博公共衛(wèi)生學(xué)院生物統(tǒng)計(jì)學(xué)系A(chǔ)ndrew E. Jaffe團(tuán)隊(duì)聯(lián)合10x Genomics，在bioRxiv發(fā)表了題為“Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex”的論文，首次運(yùn)用 10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究人腦前額葉背外側(cè)皮質(zhì)（DLPFC），得到人腦各層皮質(zhì)的基因表達(dá)譜，確定了大腦各層特異性表達(dá)基因，整合單核RNA測(cè)序（snRNAseq）數(shù)據(jù)完善了基因表達(dá)簇的空間信息，發(fā)現(xiàn)了精神分裂癥和自閉癥相關(guān)基因在腦不同層的富集，說(shuō)明了基因空間表達(dá)與疾病密切相關(guān)。最后作者還開發(fā)了一個(gè)無(wú)監(jiān)督聚類模型，可用于對(duì)那些解剖學(xué)定義不明的組織進(jìn)行空間劃分。

一 材料與方法

本研究共收集了3個(gè)神經(jīng)功能正常的捐獻(xiàn)者死后腦組織，選取前額葉背外側(cè)皮層，垂直腦表面取樣2對(duì)（4張）切片，每對(duì)包含直接相鄰的2張切片，厚度為10μm，對(duì)與對(duì)之間相距300μm，總共12張切片（圖1）。利用組織切片中灰質(zhì)/神經(jīng)元(SNAP25)、WM/少突膠質(zhì)細(xì)胞(MOBP)和L5 (PCP4)的標(biāo)記基因，勾畫出第6層(L6)與相鄰白質(zhì)(WM)之間的邊界，定位每個(gè)樣本方向。

圖1. 取材過(guò)程

二 繪制人腦DLPFC中基因表達(dá)概況

將所有樣本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，檢測(cè)到每個(gè)Spot平均有3.3個(gè)細(xì)胞、3,462條UMI和1,734個(gè)基因。利用標(biāo)記基因進(jìn)行t-SNE降維，將每個(gè)Spot歸類到6個(gè)皮層及白質(zhì)中。計(jì)算各層皮質(zhì)每個(gè)基因的總表達(dá)量，得到每層基因表達(dá)譜。將以每個(gè)Spot為單位的基因表達(dá)譜，轉(zhuǎn)化為以每層皮質(zhì)為單位的基因表達(dá)譜（圖2）。

圖2. 計(jì)算各層皮質(zhì)基因表達(dá)譜原理

三 尋找各層富集基因

得到各皮層的基因表達(dá)譜后，運(yùn)用'Enrichment' model，即：比較每一皮層相對(duì)于其他6層，顯著高表達(dá)的基因，定義為“層富集基因”。將此“層富集基因”與既往文獻(xiàn)中已發(fā)表、或明確的層標(biāo)記基因?qū)Ρ?，發(fā)現(xiàn)只有59.5%的基因在本次研究中被證實(shí)為顯著差異基因，同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了一些新的層富集基因。于是，作者使用多重單分子熒光原位雜交技術(shù)（multiplex single molecule fluorescentin situhybridization）進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)AQP4, HPCAL1, FREM3, TRABD2A,KRT17等層標(biāo)記基因的表達(dá)（圖3）。

圖3. 多重原位雜交技術(shù)驗(yàn)證新標(biāo)記基因

四 snRNA-seq/scRNA-seq亞細(xì)胞群空間位置注釋

對(duì)人腦組織snRNA-seq/scRNA-seq數(shù)據(jù)注釋其空間位置信息，有助于進(jìn)一步了解細(xì)胞亞群的功能。因此，作者利用本實(shí)驗(yàn)室既往單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)（2例人腦DLPFC組織，共5231個(gè)細(xì)胞核）進(jìn)行聚類，在 7種廣泛細(xì)胞類型中得到30個(gè)初級(jí)的細(xì)胞簇。利用各層皮質(zhì)中顯著富集的前100個(gè)基因，分析各層皮質(zhì)和白質(zhì)與亞細(xì)胞群之間，關(guān)于這700個(gè)基因表達(dá)譜的Pearson相關(guān)系數(shù)。最終，將少突膠質(zhì)細(xì)胞（Oligo）主要定位于腦白質(zhì)區(qū)（WM），星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astro）主要定位于L1，小膠質(zhì)細(xì)胞（Mircro）、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）主要定位于L1和WM，神經(jīng)元較廣泛地定位于L2~L6（圖4~5）。為了進(jìn)一步評(píng)估該 “空間位置注釋”方法的穩(wěn)定性，又應(yīng)用其他單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析、對(duì)比，最終得到相似的細(xì)胞亞群定位結(jié)果。因此，作者認(rèn)為該方法可為既往任何腦研究中的scRNA-seq或snRNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行細(xì)胞空間位置信息注釋。

圖4. snRNA-seq/scRNA-seq數(shù)據(jù)空間注釋原理

圖5. snRNA-seq/scRNA-seq數(shù)據(jù)空間注釋結(jié)果

五 疾病相關(guān)基因的皮層定位

為促進(jìn)本研究結(jié)果臨床轉(zhuǎn)化，探究疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋求更有效治療方法，作者分析了包括自閉癥譜系障礙（ASD）、精神分裂癥（SCZD）等一系列腦疾病相關(guān)基因集的皮層定位，發(fā)現(xiàn)自閉癥譜系障礙（ASD）相關(guān)基因集在特定皮層被富集（圖6）。更有趣的是，如果將102個(gè)ASD相關(guān)基因按照不同臨床表現(xiàn)歸為53個(gè)與ASD主要特征相關(guān)的基因集（ASD53）和49個(gè)與神經(jīng)發(fā)育延遲相關(guān)的基因集（ASD49），發(fā)現(xiàn)上述兩者分別被富集到L5和L2（圖7）。這表明疾病的不同臨床亞型，可能是由不同部位的不同亞類細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的。

圖6. 腦疾病相關(guān)基因集的皮層定位

圖7. ASD不同臨床癥狀的皮層定位

六 構(gòu)建數(shù)據(jù)聚類模型

由于本研究中的人腦皮層結(jié)構(gòu)及各層標(biāo)記基因已被廣泛研究、較為明確。除此之外，一些組織可能缺乏一定的解剖結(jié)構(gòu)規(guī)律及標(biāo)記基因。因此，針對(duì)這一情況，作者分別構(gòu)建了3種“非監(jiān)督”、“半監(jiān)督”、“監(jiān)督”的數(shù)據(jù)聚類方法。而非監(jiān)督方法可用來(lái)分析空間結(jié)構(gòu)不明確的組織，特別是那些與抑制神經(jīng)元亞群、腦血管系統(tǒng)或免疫功能相關(guān)的組織，以便日后將空間轉(zhuǎn)錄組更可靠地應(yīng)用于更廣泛的研究。

圖8. “非監(jiān)督”、“半監(jiān)督”、“監(jiān)督”數(shù)據(jù)聚類方法

七 總結(jié)

本研究運(yùn)用10X Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，繪制人腦DLPFC中各層基因表達(dá)譜并挖掘各層富集基因，運(yùn)用富集基因?qū)韧鵶cRNA-seq/snRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行空間注釋，并將疾病相關(guān)基因定位于特定皮層，便于臨床轉(zhuǎn)化。最終構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型，可更好地應(yīng)用于其他組織的解剖學(xué)定義。

本文作為Visium空間轉(zhuǎn)錄組在腦科學(xué)應(yīng)用的第一篇文章，展示了空間轉(zhuǎn)錄組在腦科學(xué)研究的思路，應(yīng)用了很多新穎方法，具有非常重要的意義。愛(ài)麗慕斯學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)計(jì)劃推出【Amazing brain】系列，解讀腦科學(xué)相關(guān)重磅文章。

下期預(yù)告：小編解析【Amazing brain】系列第二篇，空間轉(zhuǎn)錄組研究阿爾茲海默癥（AD）文章。

原文鏈接https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.28.969931v1

參考文獻(xiàn)

1. Maynard K，Leonardo CT, et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex.biorxiv.2020.02.28.