雄激素受體（AR）是前列腺癌（PCa）的核心驅(qū)動因子，盡管AR靶向療法已成為標準治療方案，但晚期前列腺癌常通過激活AR信號通路產(chǎn)生耐藥性，亟需發(fā)掘全新AR調(diào)控靶點以突破治療瓶頸。加州大學舊金山分校醫(yī)學系和Arc研究所團隊通過全基因組CRISPRi篩選結(jié)合內(nèi)源性AR熒光報告系統(tǒng)，首次鑒定出PTGES3（前列腺素E合成酶3）作為AR功能的直接調(diào)控因子，其靶向抑制可有效阻斷AR信號通路并抑制耐藥性前列腺癌進展。海星生物依托自主研發(fā)的CRISPRSeek?文庫篩選平臺，提供高效、精準的CRISPR文庫篩選服務，從文庫設計、病毒包裝到高通量測序及數(shù)據(jù)深度解析全流程賦能，助力科研人員快速挖掘腫瘤關鍵調(diào)控靶點與核心機制。

一、核心研究方法?

1.內(nèi)源性AR熒光報告系統(tǒng)構(gòu)建

采用拆分熒光蛋白標記策略，將mNG2熒光蛋白的11號β鏈（16個氨基酸）敲入AR基因的N端，構(gòu)建內(nèi)源性mNG2-AR融合報告細胞系（C42BmNG2-AR）。通過慢病毒在該細胞系中穩(wěn)定表達mNG2的1-10號β鏈，兩者非共價結(jié)合形成功能性熒光復合物，可實時定量檢測內(nèi)源性AR蛋白水平與定位，且不影響AR的生物學活性（圖1a-d）。

2.全基因組CRISPRi篩選發(fā)現(xiàn)AR調(diào)控因子

在穩(wěn)定表達dCas9-KRAB的C42BmNG2-AR細胞中，導入全基因組CRISPRi?sgRNA文庫?；贏R熒光信號強度，使用熒光激活細胞分選（FACS） 分離出AR蛋白水平最高和最低的細胞群體（各25%）。通過深度測序和生物信息學分析，鑒定出sgRNA顯著富集于低AR群體的基因，即那些其表達被抑制會導致AR蛋白下降的基因（圖2）。

3.多層次機制與功能驗證

分子與細胞功能：利用RNA-seq、蛋白質(zhì)組學、免疫共沉淀、鄰近連接實驗、染色質(zhì)可及性測序（ATAC-seq）和ChIP-seq等技術(shù)，全面解析PTGES3影響AR的機制。

臨床相關性分析：整合多個前列腺癌患者隊列數(shù)據(jù)，分析PTGES3表達與臨床預后的關聯(lián)。

臨床前模型驗證：在多種細胞系和患者來源異種移植（PDX）模型中，通過基因敲低和小鼠實驗，驗證PTGES3作為治療靶點的效力。

圖1.在PCa細胞中建立內(nèi)源性AR mNG2熒光報告細胞

二、研究結(jié)果

結(jié)果1：全基因組CRISPRi篩選鑒定AR調(diào)控新靶點PTGES3

篩選成功復現(xiàn)了HOXB13、GATA2等已知AR調(diào)控因子，證實了篩選體系的可靠性。在眾多新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子中，PTGES3作為頂級候選基因脫穎而出（圖2b,c）。在多個細胞模型中驗證，敲低PTGES3能顯著降低AR蛋白水平（圖2d-f）。

圖2.利用全基因組CRISPRi篩選識別AR蛋白水平調(diào)控因子

結(jié)果2：PTGES3調(diào)控AR蛋白穩(wěn)定性與功能

PTGES3敲低能在多種AR陽性前列腺癌細胞（包括恩雜魯胺耐藥株）中降低AR蛋白，但不影響其mRNA，表明其作用于翻譯后水平（圖3a-c）；還導致AR陽性癌細胞發(fā)生細胞周期阻滯和凋亡（圖3d,e）。PTGES3具有雙重功能域（N端PGE2合成酶活性位點Y9，C端HSP90互作位點W106），兩個位點的功能對于維持AR蛋白水平均不可或缺（圖3f-i）。

圖3.PTGES3是AR的調(diào)節(jié)因子

結(jié)果3：PTGES3與AR直接相互作用并促進其核內(nèi)功能

PTGES3在前列腺癌細胞中同時定位于細胞質(zhì)和細胞核，且核內(nèi)PTGES3高表達與前列腺癌患者PSA復發(fā)風險增加顯著相關（圖4a-b）。co-IP和鄰近連接實驗證實，PTGES3與AR在細胞核內(nèi)直接結(jié)合，且結(jié)合依賴AR的DNA結(jié)合域（DBD）和配體結(jié)合域（LBD）（圖4c-e）。體外重組蛋白實驗顯示，PTGES3可直接增強AR與雄激素反應元件（ARE）的結(jié)合能力，且不依賴HSP90，通過穩(wěn)定AR的DNA結(jié)合構(gòu)象發(fā)揮作用（圖4f-k）。

圖4.AR和PTGES3在有DNA和無DNA的情況下均會發(fā)生相互作用

結(jié)果4：PTGES3調(diào)控AR基因組結(jié)合與染色質(zhì)可及性

ChIP-seq分析顯示，PTGES3沉默后，AR在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點減少85%以上，包括KLK3、KLK2等經(jīng)典AR靶基因的啟動子和增強子區(qū)域（圖5c-g）。ATAC-seq結(jié)果顯示，PTGES3沉默導致的染色質(zhì)可及性變化與AR沉默高度相似，80%以上的差異可及區(qū)域與AR結(jié)合位點重疊，且AR靶基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)開放性顯著降低（圖5h-k）。

圖5.胞核中的PTGES3促進AR介導的轉(zhuǎn)錄過程

結(jié)果5：PTGES3是耐藥性前列腺癌的潛在治療靶點

PTGES3高表達與接受雄激素剝奪治療（ADT）的前列腺癌患者轉(zhuǎn)移風險增加顯著相關，且在AR靶向治療耐藥的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中，PTGES3高表達與更差的總生存期相關（圖6a、補充圖10a）。

體外療效：PTGES3敲低可顯著抑制AR驅(qū)動的前列腺癌細胞增殖，包括恩雜魯胺耐藥細胞系，但對AR陰性細胞系（PC3、DU145）無顯著影響，提示其作用依賴性AR（圖6c-h）。

體內(nèi)驗證：在LNCaP裸鼠PDX模型中，誘導性PTGES3沉默可顯著抑制腫瘤生長，且腫瘤組織中AR蛋白水平顯著降低（圖6i、補充圖10h）。

圖6.PTGES3是AR導向治療耐藥PCa的潛在治療靶點

補充圖10.在一線AR靶向治療中，PTGES3的高表達預示著晚期PCa患者預后不良

三、研究意義

本研究通過內(nèi)源性熒光報告系統(tǒng)與全基因組CRISPRi篩選的巧妙結(jié)合，完成了對AR蛋白調(diào)控網(wǎng)絡的系統(tǒng)性“普查”，成功定位關鍵樞紐基因PTGES3。研究發(fā)現(xiàn)PTGES3是維持AR蛋白穩(wěn)定的必需因子，更揭示其通過核內(nèi)直接結(jié)合，充當AR轉(zhuǎn)錄共激活因子和染色質(zhì)景觀維護者的全新機制。

PTGES3的發(fā)現(xiàn)具有重要轉(zhuǎn)化醫(yī)學價值：其作用機制獨立于現(xiàn)有AR抑制劑，為克服AR擴增、突變或剪接變體導致的耐藥提供新途徑；且在AR陽性癌細胞中的“條件性必需”特性，預示靶向PTGES3具有較好安全性。未來開發(fā)針對PTGES3的小分子抑制劑或蛋白降解劑，有望成為治療去勢抵抗性前列腺癌的新一代策略。

這項研究完美展現(xiàn)了從創(chuàng)新工具構(gòu)建、系統(tǒng)性篩選到機制解析、臨床轉(zhuǎn)化的完整研究范式，而CRISPR文庫篩選正是其中的核心技術(shù)支撐。海星生物的定制CRISPR-KO、CRISPRa、CRISPRi文庫篩選服務，可提供全基因組文庫、腫瘤相關通路定制文庫等多種選擇，技術(shù)流程覆蓋sgRNA設計、慢病毒包裝、細胞轉(zhuǎn)染、高通量測序及數(shù)據(jù)深度分析，無論是復刻本研究的靶點篩選，還是開展全新的功能基因組學研究，海星生物都能以高效、精準的技術(shù)平臺提供一站式解決方案，加速科研成果落地。

參考文獻：Li H, Melnyk J E, Fu B X H, et al. Genome-scale CRISPR screens identify PTGES3 as a direct modulator of androgen receptor function in advanced prostate cancer[J]. Nature Genetics, 2025: 1-12.