.取材

取材：盡量半小時內(nèi)完成，因為動物死后半小時蛋白酶開始發(fā)揮作用。
大小：1cm1cm0.2cm左右為宜（固定步驟）

切片

冰凍切片：10-20um,
4%甲醛：現(xiàn)配先用
-20取出后晾干15-20min,防止脫片

冰凍切片固定實驗 - 實驗方法 - 丁香通 (biomart.cn)
問題：如何選擇固定液？切片前固定還是切片后固定？
冰凍切片的雷區(qū)，你中招了嗎？公司新聞丁香通 (biomart.cn)
注意事項：切片之后要立即放入甲醇中；固定液甲醇要用PBS配不能用水。

首先甲醛固定組織，脫水，切片。然后進(jìn)行以下步驟：

1. PBS洗滌：洗滌5min*3-5次，除去包埋劑。
2. 晾干，疏水筆畫圈，防止抗體派出去
3. 通透處理，通透液體加幾滴到圈圈中：給固定后的細(xì)胞膜打孔（細(xì)胞膜蛋白不用這一步）
   通透劑有去垢劑和醇類。
   去垢劑：tritonx-100,tween
   醇類：乙醇和甲醇，醇類對可溶性蛋白和磷酸蛋白有影響，若研究的蛋白是這一類就不適合用醇類作為通透劑。
4. 封閉：減少一抗和二抗非靶點結(jié)合。常用細(xì)胞組織封閉液有5%的山羊血清，或者使用與二抗同物種的血清。也可以將其溶解在PBS里，加入3%的tritonx-100
   或者用商品化的封閉液，封閉：15-40min。
   加封閉液前先略微清晰通透液，放在PBS的清晰盒子里稍微浸泡幾秒鐘。
   用槍頭往圈圈中加封閉液。放入避光片盒中。
   5。封閉后不用洗直接進(jìn)行抗體孵育。
   抗體孵育的濃度需要自己摸索。一抗4℃過夜，PBS洗三次，進(jìn)行二抗孵育。常規(guī)室溫孵育1-2h。孵育后用PBS洗3次，晾干片子，最后封片。
   在圈圈上面及周圍滴上封片液（含DAPI，瓶裝的），蓋上蓋玻片。

共聚焦顯微鏡
三個光源：透視，熒光，激光
熒光：紫激藍(lán)，藍(lán)激綠，綠激紅
鏡頭在標(biāo)本上的是正置顯微鏡，在標(biāo)本下的是倒置顯微鏡
先開開關(guān)再開鑰匙
逐行掃描
調(diào)整采圖角度
1）染料選擇：488等
2）.......