設(shè)計引物的四種方法：
1.查詢相關(guān)SCI文獻（IF=5.0以上）
2.查詢在線的引物數(shù)據(jù)庫
3.NCBI在線設(shè)計和驗證（Primer-BLAST）
4.軟件設(shè)計（Primer6，Oligo7）
一、查詢相關(guān)SCI文獻（IF=5.0以上）
在NCBI的Pubmed上查詢相關(guān)SCI文獻，序列會出現(xiàn)在文獻里面的附件里或者是實驗方法那一部分。
二、查詢在線的引物數(shù)據(jù)庫
Primerbank：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
公司資源庫：https://www.origene.com/
公司資源庫很靠譜，但只有人和小鼠的。
公司給出的引物序列都是很靠譜的，因為都是測過好多次的。
三、NCBI在線設(shè)計和驗證（Primer-BLAST）
以ACE2為例。
（1）NCBI官網(wǎng)獲得基因序列或cDNA序列
基因序列用作普通PCR擴增，cDNA序列用作qPCR（熒光定量PCR）擴增。
通常第一個是人的基因，后面是其他物種的基因。這里以人的基因為例。
普通PCR
以ACE2的整個基因組為模板。
因為前面選擇的是Refseq數(shù)據(jù)庫的參考序列，所以這里顯示的是Refseq。
9606是人的一個編號。
這里是根據(jù)序列信息默認填上的，不用修改。
可以點擊在新窗口顯示結(jié)果。
最后Get Primers。
qPCR
以mRNA為模板。
一共有6個轉(zhuǎn)錄本。
qPCR產(chǎn)物的大小需要修改為150-250。
qPCR的退火溫度最小值需要修改為55.0，最大值需要修改為65.0。
最下面的紅色框是選擇是否需要跨越兩個外顯子。最后的結(jié)果大部分都會跨越。
（2）設(shè)計引物
普通PCR
可以看到有18個外顯子序列，設(shè)計了10對引物。
這10對引物集中在第17個外顯子和第17個內(nèi)含子區(qū)域。
qPCR
這是第三個轉(zhuǎn)錄本，一般最好選擇第一個轉(zhuǎn)錄本。
（3）挑選合適的引物
（4）驗證引物特異性
