今天是第3期細胞培養(yǎng)干貨-Hep G2，本期介紹Hep?G2細胞培養(yǎng)和基因編輯的實戰(zhàn)技巧。
Hep G2細胞是一種人源肝癌細胞系，來源于一名患有肝細胞癌的15歲白人男性的肝組織。這一細胞系具有廣泛的應用價值，可用于肝母細胞瘤和肝細胞癌體外模型的建立、肝臟藥物代謝途徑研究以及肝炎病毒感染模型的構建等。此外，經過基因編輯改造的Hep G2細胞系也是肝癌發(fā)病機制、耐藥機制和癌癥治療等領域的重要工具。
然而，要確保Hep G2細胞的穩(wěn)定性和實驗結果的可靠性，掌握良好的細胞培養(yǎng)技巧尤為重要?，F在讓小源帶大家一起來了解如何培養(yǎng)好Hep G2細胞吧。
首先，先了解一下Hep G2的基本信息。
細胞培養(yǎng)步驟
細胞復蘇
1) 準備工作：準備好所要復蘇的細胞；預熱水浴鍋至37℃；預熱完全培養(yǎng)基
2) 超凈臺內吸取7 mL已預熱好的完全培養(yǎng)基至15 mL離心管備用
3) 將細胞從干冰里取出，用鑷子夾住蓋子放入37℃水浴中快速晃動（注意：水不能沒過蓋子），使其在1分鐘左右完全融化
4) 用單道移液器將細胞懸液轉至步驟2）提前準備好的15ml離心管中，1100 rpm室溫離心 4 分鐘
5) 同時準備一個新的T25培養(yǎng)瓶，加入4mL完全培養(yǎng)基
6) 離心結束，棄去上清，加入1mL新鮮完全培養(yǎng)基重懸細胞后加入步驟5）的培養(yǎng)瓶里，放入培養(yǎng)箱
7) 第二天觀察細胞狀態(tài)及貼壁情況。
細胞傳代（以T25瓶為例）
1) 當細胞匯合度達到80%-90%時可進行傳代，傳代時在超凈臺內棄去培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液，加入5mLPBS洗滌細胞1-2次
2)?[加入1mL胰酶，輕輕晃動瓶子并使胰酶完全浸過細胞，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱孵育1-3分鐘，待在顯微鏡下觀察到大部分細胞變圓不貼壁，輕輕晃動培養(yǎng)瓶兩側有大部分細胞脫離時，立即終止消化
3) 加入2倍胰酶體積即2mL完全培養(yǎng)基終止消化，然后轉移至15mL離心管中
4) 1100 rpm室溫離心 4 分鐘，離心結束，棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸細胞
5) 細胞按照1:2-1:4比例傳代，傳代第二天觀察細胞狀態(tài)
注意事項：1.Hep G2細胞呈塊狀生長。細胞傳代消化一定要完全，輕拍培養(yǎng)瓶至細胞團塊完全脫落可進行終止消化，消化不完全的話，細胞容易聚集成團
1.重懸吹打細胞時盡量把細胞吹散，吹成單細胞，但要注意吹打力度需適中溫柔，不可大力吹打，避免對細胞造成損傷
2. 細胞對培養(yǎng)條件嚴格，特別是對血清敏感，需要選擇高質量胎牛血清進行培養(yǎng)
3. 由于細胞會呈團塊生長，復蘇后細胞形態(tài)可能會與正常細胞形態(tài)存在差異，這是正常的，經過幾次傳代后細胞形態(tài)會恢復正常
4. 細胞培養(yǎng)過程中會出現少量空泡，這是正?，F象
細胞凍存：
1) 按細胞傳代的方法，在超凈臺內把培養(yǎng)瓶里的細胞進行消化至單細胞懸液，所有液體轉移到離心管中
2) 用移液管吹打混合均勻，取20 μL進行細胞計數
3) 1100 rpm室溫離心4分鐘，離心結束棄去上清，用1~2 mL 4℃預冷的凍存液重懸細胞，隨后加入凍存液調整至密度為1*10^6個細胞/mL
4) 將細胞懸液按1 mL/管平均分裝至提前貼好標簽的凍存管中
5) 將凍存管放置于4℃預冷的程序降溫盒中，并在凍存結束的15分鐘之內將程序降溫盒放置超低溫冰箱；
6)過夜后，將凍存細胞轉移至液氮罐內保存
FAQs
如何避免細胞復蘇存活率低？
1.?復蘇時要做到快且穩(wěn)
2. 復蘇后培養(yǎng)條件選擇正確，選擇正確的培養(yǎng)基、血清、溫度、二氧化碳濃度等，避免過度振動培養(yǎng)皿，減少對細胞的機械損傷
3.?復蘇時可先接種至小培養(yǎng)皿培養(yǎng)，待小培養(yǎng)皿長滿后再進行擴增
4.?凍存前要確保細胞處于良好的生長狀態(tài)
5.可在凍存前消化終止離心結束后用PBS洗滌細胞兩次后再加凍存液重懸細胞
6. 可適當提高凍存密度
細胞狀態(tài)差如何調整？
1.?培養(yǎng)基和血清：確保使用正確的基礎培養(yǎng)基和加入適量血清；Hep G2細胞可提高血清濃度進行培養(yǎng)
2.?細胞培養(yǎng)環(huán)境：確認培養(yǎng)溫度、濕度、氣相條件是否正常
3.?細胞傳代、換液操作：細胞傳代時，注意消化時間和胰酶濃度，避免因消化時間過長或過短導致的細胞損傷；一般2～3天進行一次換液，避免長時間不進行換液處理
4.細胞復蘇及凍存：確保細胞復蘇和凍存操作規(guī)范，以減少細胞損傷和死亡
5. 若細胞密度低，可提高細胞密度至70%以上，細胞密度大，細胞分泌的細胞因子多，有利于細胞增殖。
細胞表面存在死細胞如何處理？
1. 用PBS搖晃清洗兩次，然后加入胰酶進行搖晃潤洗，待觀察到表面的死細胞有要飄起來的跡象時，快速棄掉胰酶
2. 再次加入PBS清洗細胞，然后加入胰酶正常消化
3. 可在消化終止離心結束后加入PBS重懸再洗細胞一次
基因編輯小Tips
Hep G2細胞如何提高轉染效率？
1.確保細胞狀態(tài)良好，細胞處于對數生長期，細胞密度適中
2.注意細胞消化時間，避免過度消化，對細胞造成傷害
3.細胞進行實驗時建議活率＞80%
4.實驗過程中細胞要吹打成單細胞，避免細胞聚團
5.使用不同轉染方法，要注意的細節(jié)也有所不同，小源列舉了常用的電轉法和慢病毒法。
Hep G2細胞如何提高單克隆形成率？
1.細胞鋪克隆時活率需要＞80%
2.鋪克隆時選擇使用優(yōu)質胎牛血清
3.鋪克隆可用PBS清洗1次
又是干貨滿滿的一天，希望這些干貨分享能讓大家對培養(yǎng)和轉染Hep G2細胞更加充滿信心！
