<p>細(xì)胞不僅是生物實(shí)驗(yàn)的重要材料，也是生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。大多數(shù)關(guān)于藥物、基因功能和疾病機(jī)制的研究都需要在細(xì)胞水平上進(jìn)行解釋。然而，細(xì)胞培養(yǎng)受人員操作和環(huán)境條件的影響很大。細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常會(huì)遇到很多細(xì)節(jié)問(wèn)題，每個(gè)問(wèn)題都可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗。本文總結(jié)了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)與大家分享，希望對(duì)大家的細(xì)胞培養(yǎng)有所幫助。</p><div class="image-package"><img src="https://upload-images.jianshu.io/upload_images/29008475-22738e2b9fae3737.jpeg" img-data="{"format":"jpeg","size":210483,"height":1707,"width":1280}" class="uploaded-img" style="min-height:200px;min-width:200px;" width="auto" height="auto"/>
</div><p>1.細(xì)胞系的身份需要明確。</p><p>由于所選細(xì)胞系的某些特性符合研究方向的設(shè)定，因此我們選擇了某一細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。例如組織特征、疾病特征、功能特征、基因表達(dá)特征等。一旦使用了錯(cuò)誤的細(xì)胞株，對(duì)我們研究結(jié)果的判斷就會(huì)產(chǎn)生很大的誤差和不確定性。</p><p>近幾年來(lái)，許多權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞系的培養(yǎng)和流通過(guò)程中，存在著嚴(yán)重的交叉污染。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅僅因?yàn)镠ela細(xì)胞系統(tǒng)造成的污染就導(dǎo)致了3萬(wàn)多篇論文結(jié)果的準(zhǔn)確性，而這種情況并不局限于Hela細(xì)胞。許多權(quán)威機(jī)構(gòu)的研究人員發(fā)現(xiàn)，超過(guò)451個(gè)細(xì)胞系統(tǒng)已被其他細(xì)胞完全吸收，46%的細(xì)胞污染被檢測(cè)到?？梢钥闯?，細(xì)胞交叉污染非常普遍。所以，在做實(shí)驗(yàn)之前，驗(yàn)證細(xì)胞株的正身是非常重要的。若是在機(jī)構(gòu)內(nèi)購(gòu)買的細(xì)胞株，最好讓供應(yīng)商提供合格的STR鑒定報(bào)告。</p><p>目前，STR基因分類法是細(xì)胞交叉污染和性質(zhì)鑒定最有效、最準(zhǔn)確的方法之一，是ATCC等權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可的黃金標(biāo)準(zhǔn)。不幸的是，并非所有細(xì)胞都可以通過(guò)STR進(jìn)行識(shí)別。目前，只有大多數(shù)人類細(xì)胞株和45種小鼠細(xì)胞株可以進(jìn)行識(shí)別。其它細(xì)胞株可結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、特性和物種鑒定進(jìn)行確認(rèn)。</p><p>二、培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇。</p><p>1.準(zhǔn)備工作：</p><p>根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特性，提前準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和血清。為了避免細(xì)胞在新環(huán)境下需要過(guò)渡適應(yīng)，最好遵循細(xì)胞原有的培養(yǎng)條件。與此同時(shí)，充分了解細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和形態(tài)特性，便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。</p><p>2.貼壁細(xì)胞的傳代：</p><p>1)移除使用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)液。(不要直接倒出，以免造成瓶口殘留物污染)</p><p>2)用平衡鹽溶液(PBS)沖洗細(xì)胞，不含鈣鎂離子。輕輕地將沖洗液從與壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)加入，以免攪動(dòng)細(xì)胞層，前后搖動(dòng)容器數(shù)次，最后將沖洗液移除。(洗掉殘留的血清，避免影響胰酶的活性。)</p><p>3）以25cm2的培養(yǎng)瓶為例，在瓶中加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請(qǐng)根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的指導(dǎo)使用適當(dāng)?shù)臐舛龋┫?，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液在所有細(xì)胞表面流動(dòng)，并在37℃下孵化。通常，在幾分鐘內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)量會(huì)收縮，細(xì)胞間隙會(huì)增加。傾斜培養(yǎng)瓶時(shí)，細(xì)胞層可以自然流下。此時(shí)，應(yīng)添加含有2-3ml血清的完整培養(yǎng)液，以終止消化（請(qǐng)參考每個(gè)細(xì)胞的指導(dǎo)方針進(jìn)行細(xì)胞分離所需的時(shí)間，建議每30秒在顯微鏡下觀察細(xì)胞分離）。此外，并非所有貼壁細(xì)胞都適合使用胰蛋白酶進(jìn)行解離，請(qǐng)根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的指導(dǎo)選擇合適的解離方法。</p><p>4）傾斜培養(yǎng)瓶，吸收培養(yǎng)瓶中的液體，輕輕地沖向原細(xì)胞生長(zhǎng)表面，重復(fù)這個(gè)動(dòng)作2-3次，使所有細(xì)胞沿著瓶底流下，然后輕輕地將細(xì)胞吹成單個(gè)懸浮液（吹氣過(guò)程中應(yīng)避免氣泡）。</p><p>PS：對(duì)難以消化的細(xì)胞，盡量不要用力吹打來(lái)處理，以免對(duì)細(xì)胞造成物理?yè)p傷。先將消化后的細(xì)胞分離出來(lái)，及時(shí)停止消化。然后再次消化仍然靠近墻壁的細(xì)胞。實(shí)現(xiàn)分層消化，避免胰酶消化下易消化細(xì)胞長(zhǎng)期受損。</p><p>5)將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移除上清。</p><p>6)加入新的含血清完全培養(yǎng)液，重新懸掛成單細(xì)胞懸液。按照各種細(xì)胞指引推薦的傳代比例，將細(xì)胞懸液均勻地分配到各種培養(yǎng)器皿中，補(bǔ)充新的含血清完全培養(yǎng)液，輕輕搖勻。</p><p>7)放入37℃孵化，第二天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況。</p><p>3.懸浮細(xì)胞的傳代：</p><p>由于懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞不靠近墻壁，因此在傳代過(guò)程中不需要使用酶消化法，而是可以直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。</p><p>1）直接傳代時(shí)，靜置5-10分鐘。懸浮細(xì)胞慢慢沉淀到容器底部后，吸收1/2-2/3的原始培養(yǎng)液，補(bǔ)充新鮮含血清的完整培養(yǎng)液，混合成細(xì)胞懸浮液。按照每個(gè)細(xì)胞指引推薦的傳代比例，將細(xì)胞懸液均勻地分配到每個(gè)培養(yǎng)器皿中，輕輕搖勻。</p><p>2)離心傳代時(shí)，將細(xì)胞和培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心時(shí)間為800-1000rpm3-5分鐘。去除上清后，加入新鮮的含血清完全培養(yǎng)液。按照各種細(xì)胞指引推薦的傳代比例，將細(xì)胞懸液均勻地分配到各種培養(yǎng)器皿中，補(bǔ)充新鮮的含血清完全培養(yǎng)液，輕輕搖勻。</p><p>3)放入37℃孵化，第二天在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況。</p><p>4.壁掛式懸浮混合細(xì)胞的傳代：</p><p>首先收集懸浮細(xì)胞，然后參考“貼壁細(xì)胞傳代”方法進(jìn)行消化收集，一起接種培養(yǎng)器皿。</p><p>PS：在懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞密度的要求一般較高，在培養(yǎng)過(guò)程中最好參考指南來(lái)控制細(xì)胞密度，不能過(guò)密或過(guò)稀。</p><p>5.細(xì)胞凍結(jié)：</p><p>1)按照“細(xì)胞傳代步驟”中的方法收集細(xì)胞。</p><p>2）加入細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存液（一般為10%DMSO+相應(yīng)細(xì)胞的完整培養(yǎng)液），使細(xì)胞的最終密度為（510）×105/ml，并將其移入細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存管。</p><p>3)程序冷卻(以需要異丙醇的Nalgene程序冷卻盒為例)：4℃30min→-80℃過(guò)夜→液氮。(4℃30min一定不能省略，否則凍存液不能滲透到細(xì)胞中，容易產(chǎn)生冰晶，造成細(xì)胞損傷。)</p><p>6.細(xì)胞復(fù)蘇：</p><p>1）取出儲(chǔ)存的細(xì)胞。液氮揮發(fā)后，立即在37℃的水浴中輕輕搖動(dòng)以快速融化（通常在2分鐘內(nèi)，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)隨著時(shí)間的推移而受到影響）。為了避免凍存管因溫差劇烈變化而爆裂，操作此步驟時(shí)請(qǐng)戴上防護(hù)面罩或防護(hù)目鏡。</p><p>PS：冷凍細(xì)胞用干冰運(yùn)輸，收到后需立即放入深低溫冰箱或液氮中，至少3d后再進(jìn)行復(fù)蘇操作。</p><p>2)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌控制臺(tái)，用75%酒精擦拭冷凍存管外部。</p><p>3)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含血清完全培養(yǎng)液離心管中，含血清預(yù)熱10-20ml，800-1000rpm離心3-5分鐘，將上清移除。</p><p>4)將含血清完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞重新加入預(yù)熱后，以約(35)×105/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。</p><p>5)放入37℃孵化，第二天在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況。</p><div class="image-package"><img src="https://upload-images.jianshu.io/upload_images/29008475-42dbbeb2fd5c37ad.jpeg" img-data="{"format":"jpeg","size":1560270,"height":3072,"width":4096}" class="uploaded-img" style="min-height:200px;min-width:200px;" width="auto" height="auto"/>
</div><p>三、污染防治。</p><p>1.細(xì)菌污染。</p><p>細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的污染，主要是由于操作不慎或使用消毒不完全的耗材和試劑引入。最常見(jiàn)的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌和白葡萄球菌。鏡下形狀為長(zhǎng)桿狀、短桿狀、顆粒狀等。</p><p>左邊是比較典型的桿菌污染，一般桿菌會(huì)延軸快速游動(dòng)，量少時(shí)培養(yǎng)基會(huì)澄清。右邊的圖片是顆粒狀污染，一般培養(yǎng)基會(huì)渾濁或有白沙沉淀。</p><p>好氧細(xì)菌迅速增殖和分裂，培養(yǎng)基可在感染后24小時(shí)內(nèi)渾濁；厭氧細(xì)菌在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下緩慢增殖，觀察渾濁需要很長(zhǎng)時(shí)間。</p><p>污染處理：由于抗生素在國(guó)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中的廣泛使用，污染后添加雙抗體（青霉素和鏈霉素、Penicillin+Streptomycin）通常無(wú)效。桿菌可以用100ug/ml慶大霉素治療一周，顆粒狀細(xì)菌可以用25ug/ml環(huán)丙沙星治療一周，效果比較好。</p><p>2.真菌污染。</p><p>煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的污染真菌。</p><p>左邊的圖片是典型的霉菌污染圖片，右邊的圖片是酵母污染，鏡子下可以看到明顯的發(fā)芽形態(tài)。</p><p>污染處理：可使用100ug兩性霉素B/T25瓶，治療一周。</p><p>注意：兩性霉素毒性較大，需要在細(xì)胞超過(guò)50%且狀態(tài)沒(méi)有受到很大影響之前進(jìn)行治療。</p><p>3.支原體污染。</p><p>支原體的危害：支原體污染能改變細(xì)胞的特性。例如，一些支原體會(huì)迅速消耗培養(yǎng)液中的精氨酸，并與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，從而減緩或停止細(xì)胞的生長(zhǎng)；同時(shí)，支原體還可以改變細(xì)胞的酶譜和細(xì)胞膜成分，導(dǎo)致細(xì)胞染色體異?；蚣?xì)胞病理變化。上述情況會(huì)嚴(yán)重影響使用這些細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)論不可靠。</p><p>(PCR法檢測(cè)細(xì)胞上清中的支原體污染)</p><p>支原體的預(yù)防和清除：由于支原體不能直接在鏡子下看到，因此需要通過(guò)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，因此污染后很難找到。建議每月對(duì)養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行一次檢測(cè)，并結(jié)合每周抽樣檢測(cè)，以便早期發(fā)現(xiàn)污染。對(duì)正在進(jìn)行支原體去除處理的細(xì)胞，建議每周進(jìn)行一次必要的檢查，直到出現(xiàn)陰性結(jié)果，并至少維持一個(gè)月。對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行分離處理，優(yōu)先對(duì)“支原體陰性”細(xì)胞進(jìn)行處理，然后對(duì)受感染的細(xì)胞進(jìn)行去除處理。與此同時(shí)，所有新引進(jìn)的細(xì)胞系都進(jìn)行了支原體檢測(cè)，以確保實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有新的污染。</p><p>4.預(yù)防和控制實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞污染。</p><p>建立良好的規(guī)章制度對(duì)減少細(xì)胞污染有很大幫助。包括準(zhǔn)入系統(tǒng)、操作規(guī)范和日常管理系統(tǒng)。</p><p>訪問(wèn)系統(tǒng)：包括人員和材料。人員在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前需要進(jìn)行培訓(xùn)，并且必須符合穿著要求，如白大褂、隔離服、口罩、手套等。而且所需的物品，非一次性物品要嚴(yán)格消毒滅菌，而購(gòu)買的物品要從正規(guī)、可靠的渠道購(gòu)買。新購(gòu)買的細(xì)胞在使用前應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證。</p><p>操作規(guī)范：最好制定常規(guī)操作規(guī)范，實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)遵循操作規(guī)范，不得隨意更改。同時(shí)，也是培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)人員良好的操作習(xí)慣。例如，槍頭滴管吸入后，不再再次伸入培養(yǎng)基中吸入，一次吸入足夠量的培養(yǎng)基。在加液時(shí)也要盡量做到懸空加液，這樣可以有效地防止支原體污染和細(xì)胞交叉污染。此外，如果可能的話，一次只能操作一個(gè)細(xì)胞，最好在細(xì)胞和細(xì)胞之間有一點(diǎn)時(shí)間間隔，以避免交叉污染。</p><p>日常管理制度：包括使用、清潔、維護(hù)等各方面的規(guī)則、方法，如環(huán)境和耗材試劑。還有試劑耗材等的消耗、庫(kù)存和采購(gòu)管理，包括細(xì)胞樣品的二級(jí)庫(kù)存管理。對(duì)難以發(fā)現(xiàn)的污染源，最好定期檢測(cè)，主要是支原體污染和細(xì)胞交叉污染。</p><div class="image-package"><img src="https://upload-images.jianshu.io/upload_images/29008475-befdf9ea36f6ddd6.jpeg" img-data="{"format":"jpeg","size":100608,"height":1202,"width":900}" class="uploaded-img" style="min-height:200px;min-width:200px;" width="auto" height="auto"/>
</div><p>四、總結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的問(wèn)題。</p><p>新購(gòu)買或贈(zèng)送的細(xì)胞。</p><p>1.如何處理新購(gòu)買或贈(zèng)送的細(xì)胞？</p><p>無(wú)論你購(gòu)買的細(xì)胞還是禮物的細(xì)胞，當(dāng)你第一次得到它們時(shí)，你都應(yīng)該迅速做這些事情：檢查瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否泄漏，是否渾濁；是否有支原體污染；快速擴(kuò)大冷凍儲(chǔ)存。</p><p>2.是否可以使用與原培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？</p><p>沒(méi)有。每個(gè)細(xì)胞株都有自己的特定使用和適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。如果突然使用不同于原始培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基，大多數(shù)細(xì)胞無(wú)法立即適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法生存。</p><p>3.購(gòu)買的細(xì)胞死亡或存活率差的可能原因？</p><p>常見(jiàn)原因可能有：培養(yǎng)基使用不當(dāng)或培養(yǎng)基質(zhì)量差；血清使用不當(dāng)或血清質(zhì)量差；解凍過(guò)程中的錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，清洗細(xì)胞并離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用不當(dāng)；培養(yǎng)箱的氣體濃度不能滿足要求；細(xì)胞在-80℃下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。</p><p>恢復(fù)冷凍細(xì)胞。</p><p>4.為什么收到的冷凍管瓶體破裂，瓶蓋有裂紋，或者瓶蓋脫落？</p><p>冷凍管瓶蓋開(kāi)裂或瓶體開(kāi)裂可能是由于操作人員夾緊冷凍管時(shí)用力不當(dāng)造成的，導(dǎo)致冷凍管開(kāi)裂。建議使用止血鉗仔細(xì)夾緊。此外，冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松動(dòng)是由于熱膨脹和冷收縮造成的物理現(xiàn)象。冷凍管可能會(huì)造成細(xì)胞污染。因此，當(dāng)放入和取出液氮桶時(shí)，冷凍管應(yīng)立即再次擰緊。</p><p>5.冷凍管應(yīng)該如何解凍？</p><p>將冷凍管從液氮桶中取出解凍時(shí)，一定要注意安全，戴上防護(hù)眼鏡和手套，防止冷凍管爆裂。取出冷凍管后，應(yīng)立即放入37℃的水浴環(huán)境中快速解凍。輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)完全融化，以避免水滲入細(xì)胞，形成細(xì)胞內(nèi)的再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。并且注意水面不能超過(guò)冷凍管蓋的邊緣，否則容易發(fā)生污染。</p><p>6.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)立即去除DMSO？</p><p>
</p><p>目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將在解凍細(xì)胞后添加培養(yǎng)液來(lái)去除DMSO。然而，一些研究人員認(rèn)為，除了少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感的細(xì)胞外，大多數(shù)細(xì)胞株（包括懸浮細(xì)胞）可以直接放入含有10~15毫升新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，第二天更換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO，以避免解凍后大多數(shù)細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或附著的問(wèn)題。</p>
