Nature | 單細(xì)胞RNA測序揭秘神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)連接的時間控制機(jī)制

原創(chuàng)?舊島望月亮?圖靈基因?

收錄于話題#前沿生物大數(shù)據(jù)分析

撰文：舊島望月亮

IF=49.962

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亮點(diǎn)：

1.通過計(jì)算時間動態(tài)分?jǐn)?shù)和細(xì)胞類型變化分?jǐn)?shù)，對不同RNA的功能進(jìn)行了驗(yàn)證和推測。

2.利用RNA干擾和GAL4-UAS系統(tǒng)，揭示了神經(jīng)元相互連接的時控機(jī)制。

個體的行為取決于腦內(nèi)的神經(jīng)環(huán)路，而環(huán)路之間神經(jīng)元的相互連接又受到免疫球蛋白、鈣粘附素家族等細(xì)胞表面蛋白的影響。先前一些報道已經(jīng)部分揭示了神經(jīng)元特異性連接的機(jī)制，然而研究人員對如何在恰當(dāng)?shù)臅r間發(fā)生神經(jīng)元間的相互連接這一問題仍不清楚。蛻皮激素相關(guān)通路作為昆蟲發(fā)育的主要時間調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在幼蟲蛻皮和變態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。因此加州大學(xué)洛杉磯分校S. Lawrence Zipursky等人利用果蠅模型研究蛻皮激素及其下游轉(zhuǎn)錄因子在視神經(jīng)元的靶向識別和突觸發(fā)生過程中的調(diào)節(jié)作用。其研究結(jié)果發(fā)表在名為”A global timing mechanism regulates cell-type-specific wiring programmes”的文章中。

在先前的研究中，作者利用單細(xì)胞RNA測序獲得了果蠅視葉*神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集包含97種細(xì)胞類型，并且作者在蛹形成后的24-96小時內(nèi)采集了不同時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)共7次。計(jì)算數(shù)據(jù)集內(nèi)不同類型RNA的時間動態(tài)分?jǐn)?shù)和細(xì)胞類型變化分?jǐn)?shù)(圖1a)，前者得分越高表示對應(yīng)基因表達(dá)量隨時間波動越大，后者得分越高說明對應(yīng)基因表達(dá)的細(xì)胞特異性越強(qiáng)。研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大部分基因的時間動態(tài)性和細(xì)胞類型特異性與先前報道相一致。例如以核糖體蛋白編碼基因(RpL36,?圖1a左下坐標(biāo)系)為代表的管家基因，在兩個維度上得分都很低，說明其在各類細(xì)胞中均有表達(dá)且表達(dá)量不隨時間變化。

*視葉：昆蟲前腦的側(cè)葉，為視覺的神經(jīng)中心。

一些具有高細(xì)胞類型特異性和低時間動態(tài)性的轉(zhuǎn)錄因子(例如erm，圖1a左上坐標(biāo)系)，主要在確定和維持神經(jīng)元類型中發(fā)揮作用。而具有高時間動態(tài)性的核受體轉(zhuǎn)錄因子(如Hr3, Hr4?和ftz-f1，圖1a左上坐標(biāo)系粉色)，在視覺系統(tǒng)神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)時間和順序與蛻皮激素的波動有關(guān)(圖1b)。盡管上述轉(zhuǎn)錄因子在所有神經(jīng)元內(nèi)均有表達(dá)，但已有研究表明在某些情況下它們能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞類型特異性。此外，編碼細(xì)胞表面蛋白及其類似物的“連接基因”(wiring genes，如beat-IIIc，右上坐標(biāo)系)在兩個維度上得分均較高。目前已有研究報道了調(diào)控”連接基因”細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄因子，但調(diào)控它們時間動態(tài)性的因素仍然未知。因此作者猜想蛻皮激素相關(guān)通路通過調(diào)控“連接基因”的時間動態(tài)性和細(xì)胞類型特異性，影響果蠅視神經(jīng)元的突觸發(fā)生過程。

圖1?具有時間動態(tài)性的“連接基因”和蛻皮激素通路轉(zhuǎn)錄因子

為了驗(yàn)證上述猜想，作者利用GAL4-UAS系統(tǒng)*促使果蠅腦內(nèi)神經(jīng)元特異性表達(dá)EcRDN基因*。由于后者編碼的蛋白不能與配體相結(jié)合，因此可以通過比較WT型與EcRDN型果蠅視神經(jīng)元的差異推斷蛻皮激素的功能。觀察不同神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)沉默EcR基因使多種視神經(jīng)元的軸突、樹突分支發(fā)育不良(圖2b-d)。

*GAL4-UAS系統(tǒng)：存在于酵母中的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。有研究者使GAL4在果蠅的特定組織中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GAL4能特異性激活與UAS相連接的下游基因的轉(zhuǎn)錄。因此該系統(tǒng)后來被用于在組織或細(xì)胞中進(jìn)行RNA干擾（RNAi）或插入dorminant-negative組件造成基因沉默或使或基因表達(dá)量降低。

*文中EcR指蛻皮激素受體，EcRDN代表插入dorminant-negative組件后使EcR基因沉默。

接著，作者研究了蛻皮激素通路對薄板*上L5神經(jīng)元的突觸發(fā)生的作用。在蛹的發(fā)育過程中L5神經(jīng)元軸突末端會延伸到髓質(zhì)(Medulla)的M5區(qū)域，然后在M1形成分支，隨后這些分支從M1延伸到M2層(圖2f)。在髓質(zhì)上沉默L5神經(jīng)元的EcR基因不會影響對M5的定位，但會抑制在M1和M2中形成分支(圖2g)。此外用RNA干擾蛻皮激素下游的Hr3和ftz-f1轉(zhuǎn)錄因子，也能抑制L5神經(jīng)元軸突分支從M1延伸到M2。相反，在薄板沉默EcR能促進(jìn)L5神經(jīng)元的樹突在薄板上的生長(圖2h)。上述研究提示，蛻皮激素通路調(diào)節(jié)L5神經(jīng)元連接性的機(jī)制可能是一方面抑制該神經(jīng)元在薄板上的突觸發(fā)生，而另一方面促進(jìn)其在髓質(zhì)上的突觸發(fā)生(圖2i)。

*薄板(Lamina)：果蠅大腦的某一腦區(qū)。

圖2?蛻皮激素通路調(diào)節(jié)L5神經(jīng)元連接性

利用視神經(jīng)元標(biāo)記物分選細(xì)胞后，通過單細(xì)胞RNA測序技術(shù)比較WT型和EcRDN型L5神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)沉默EcR后有872個基因下調(diào)，517個基因上調(diào)(圖3a)。對上述基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)蛻皮激素通路能調(diào)控“連接基因”和細(xì)胞表面蛋白基因的表達(dá)，還能影響ATP合成和神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)入囊泡的過程(圖3b)。值得注意的是，許多具有時間動態(tài)性的基因不受沉默EcR基因的影響，這表明可能存在其他的時間調(diào)控因子。

圖3?蛻皮激素通路對連接基因的調(diào)節(jié)作用

此外，有研究發(fā)現(xiàn)具有高細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄因子erm僅在有絲分裂后的L3神經(jīng)元中表達(dá)，并且調(diào)控多個L3神經(jīng)元的“連接基因”。雖然erm在整個發(fā)育過程中基因表達(dá)水平幾乎恒定，但其下游許多基因的表達(dá)都存在動態(tài)變化(圖4a)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，erm和蛻皮激素通路共同調(diào)控的基因的表達(dá)量也會隨時間發(fā)生變化，因此作者推測erm和蛻皮激素通路共同調(diào)節(jié)了L3神經(jīng)元中“連接基因”的時間動態(tài)性。已有研究表明L3神經(jīng)元能調(diào)控R8神經(jīng)元向髓質(zhì)生長，因此作者試圖進(jìn)一步探究該過程的調(diào)控因子。在驗(yàn)證沉默EcR基因能抑制R8神經(jīng)元的突觸生長后(圖4b)，作者對erm和蛻皮激素通路共同調(diào)控的12個基因進(jìn)行了RNA干擾，隨后分析R8神經(jīng)元的突觸發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)beat-IIa、CG4822、CG6044和Tpr2基因在該過程中起著重要作用(圖4c)。其中beat-IIa和CG6044是免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)，能介導(dǎo)細(xì)胞識別過程。Tpr2能調(diào)節(jié)哺乳動物類固醇激素受體的活性，過度表達(dá)或敲除該基因都會導(dǎo)致激素受體活性降低(這與圖4c結(jié)果相一致)。CG4822屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，參與膽固醇和類固醇外排。

圖4 erm與蛻皮激素通路的共同靶點(diǎn)

綜上所述，該文章證明了在腦發(fā)育過程中蛻皮激素通過促進(jìn)視覺系統(tǒng)神經(jīng)元的軸突發(fā)生，調(diào)節(jié)了神經(jīng)環(huán)路的連接。作者認(rèn)為腦內(nèi)存在一個高度整合的系統(tǒng)，用于調(diào)控神經(jīng)元相互連接的細(xì)胞類型特異性以及時間動態(tài)性。由于該文章提出可能存在其它的時間調(diào)控分子，連接的時控機(jī)制還有賴于進(jìn)一步的研究。

教授介紹

S. LawrenceZipursky為加州大學(xué)洛杉磯分校生物化學(xué)系的教授，主要研究神經(jīng)科學(xué)和發(fā)育生物學(xué)。他的團(tuán)隊(duì)以果蠅為模型，探究多種神經(jīng)發(fā)育過程的調(diào)控基因。例如利用遺傳和生物化學(xué)技術(shù)，揭示了編碼細(xì)胞表面蛋白家族的Dscam1位點(diǎn)在果蠅神經(jīng)環(huán)路形成中的作用。此外，他還與同事合作研究視覺刺激對初級視覺皮層細(xì)胞發(fā)育的影響。他的研究成果發(fā)表在Nature、Science、Cell等高分雜志上。

參考文獻(xiàn)

Jain S, Lin Y, Kurmangaliyev YZ,Valdes-Aleman J, et al. A global timing mechanism regulates cell-type-specificwiring programmes. Nature. 2022. doi: 10.1038/s41586-022-04418-5.