這篇文章于2023年2月發(fā)表于Nature Cell Biology（IF=28，Stiff matrix induces exosome secretion to promote tumour growth）,是一篇探討腫瘤細胞微環(huán)境對腫瘤細胞外泌體分泌影響及其分子機制的文章，做相關(guān)方向機制沒有思路的同學(xué)可以借鑒一下。

研究意義：組織纖維化和隨之產(chǎn)生的胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的變硬和肝細胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌和乳腺癌等多種腫瘤進展有關(guān)。已知變硬的ECM可促進細胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和化學(xué)耐藥，這與胞外基質(zhì)變硬導(dǎo)致的細胞所受張力增加有關(guān)。具體機制則與細胞膜中的整合素蛋白（Integrins）感應(yīng)ECM硬度，進而通過調(diào)節(jié)細胞黏附分子將信號傳到至胞內(nèi)，促進肌動蛋白等骨架蛋白的重構(gòu)和相應(yīng)信號通路的激活。雖然ECM硬度調(diào)控胞內(nèi)信號通路相關(guān)機制已得到了廣泛研究【1】（圖1），但基質(zhì)硬度如何影響腫瘤微環(huán)境和細胞間相互作用，從而促進腫瘤進展仍是未解之謎。外泌體（直徑40-160nm）是細胞分泌的胞外囊泡，通過攜帶的蛋白和小RNA等分子影響細胞功能，其具體形成過程見圖2【2】（圖2）。小GTP酶Rab家族成員是調(diào)節(jié)外泌體合成和分泌的主要調(diào)控因子。研究表明，外泌體可以通過影響腫瘤微環(huán)境促進腫瘤遷移進展，但基質(zhì)產(chǎn)生的致癌信號是通過何種機制調(diào)控外泌體分泌仍是未知。

圖1

圖2

研究策略：為研究細胞外基質(zhì)硬度對細胞外泌體分泌的影響及其可能機制，作者首先構(gòu)建了不同硬度基質(zhì)培養(yǎng)腫瘤細胞的模型，然后檢測其對細胞外泌體分泌的影響。為找到調(diào)控該過程的重要信號通路，作者用定量蛋白組學(xué)進行了篩選，然后作者對篩選到的相關(guān)通路蛋白進行了功能驗證和深層機制解析。

研究方法：

1、Matrix stiffening promotes exosome secretion （確定基質(zhì)硬度是否與外泌體分泌有關(guān)）

為了證實基質(zhì)硬度對外泌體分泌的影響，作者探究了不同基質(zhì)硬度是否影響肝癌細胞Huh7外泌體的分泌。結(jié)果表明，高硬度基質(zhì)培養(yǎng)的細胞分泌的外泌體數(shù)量和外泌體總蛋白更多（圖3 A-D）。除此之外，作者還在原代肝癌細胞、乳腺癌細胞系和胰腺癌細胞系進行了驗證，結(jié)果與Huh7一致（圖3 E-G）。由此，作者得出第一個重要結(jié)論：ECM的硬度與癌細胞外泌體分泌呈正相關(guān)。

圖3

2、Akt promotes exosome secretion from cells grown on stiff matrix（找到基質(zhì)硬度影響外泌體分泌的相關(guān)信號通路）

為了找到基質(zhì)硬度調(diào)控細胞外泌體分泌的相關(guān)信號通路，作者用定量蛋白組學(xué)對不同硬度培養(yǎng)環(huán)境Huh7細胞的蛋白譜改變進行了檢測。結(jié)果顯示，S473 Akt及其下游S65 4E-BP1和S9S21 GSK-3的磷酸化顯著增加（圖4A-B）（同時，作者還發(fā)現(xiàn)Notch信號通路激活，這在后面第5部分會講到）。接下來，作者直接在細胞中過表達持續(xù)激活的Akt，結(jié)果顯示，細胞外泌體的分泌顯著增加（圖4C）。相反，Akt抑制劑MK2206能顯著抑制外泌體的分泌（圖4D-E）?？紤]到FAK磷酸化對基質(zhì)硬度引起的基質(zhì)張力和Akt激活增加，作者用FAK抑制劑PND1168進行了干預(yù)【3,4】。結(jié)果顯示，PND1168顯著抑制了高硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞的Akt磷酸化和外泌體分泌（圖4F-G）。由此，作者找到了基質(zhì)硬度調(diào)控Akt磷酸化的信號通路，接下來就是找到Akt磷酸化與外泌體分泌的相關(guān)信號通路的探究。

圖4

3、Matrix stiffening leads to Rab8 activation that regulates exosome secretion（繼續(xù)探究Akt磷酸化調(diào)控外泌體分泌的具體信號通路）

為了找到Akt調(diào)控外泌體分泌的具體通路，作者把研究重點集中在囊泡運輸主要調(diào)控蛋白小GTP酶Rab家族上。具體而言，作者探究了Akt激活對囊泡的胞外運輸至關(guān)重要的Rab27和Rab8影響。結(jié)果顯示，高硬度基質(zhì)培養(yǎng)的細胞其GTP-Rab8與經(jīng)典下游效應(yīng)蛋白JFC1結(jié)合增加，而同為JFC1上游的GTP-Rab27，其與JFC1的相互作用沒有顯著改變（圖5A）。而MK2206處理降低GTP-Rab8水平也表明，高硬度基質(zhì)條件下的Rab8可以被Akt激活（圖5B）。接下來，為了證明Rab8在高硬度基質(zhì)條件下細胞外泌體分泌中的作用，作者在Hub7細胞內(nèi)過表達Rab8。結(jié)果顯示，Rab8過表達促進了外泌體分泌，而MK2206則可以抑制該效應(yīng)（圖5C-D）。相反，敲低Rab8則可以抑制外泌體分泌，且添加MK2206無顯著的抑制效應(yīng)（圖5E-F）。由此，作者找到了基質(zhì)硬度調(diào)控Akt激活的直接下游Rab8。那么，Akt是如何調(diào)控Rab8的激活的呢？

圖5

4、Rabin8 is phosphorylated and activated by Akt（Akt調(diào)控Rab8活性的機制）

Rab8的GTP化和激活需要Rabin8的調(diào)控，而Rabin8的敲低能顯著抑制高硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞的外泌體分泌（圖6A-B）。接下來，作者對Rabin8進行了序列分析和質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)了“142LSRLRSPS*VLEVREK156”這段磷酸化序列，該序列保守型較高，并與Akt磷酸化底物基序“RxrXXS/T”相匹配。研究發(fā)現(xiàn)，上述絲氨酸位點的磷酸化（Serine149）在過表達持續(xù)激活A(yù)kt的細胞中顯著增加，而突變?yōu)楸彼岷?，該磷酸化現(xiàn)象消失（圖6C）。進一步在高硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，Rabin8的上述磷酸化顯著增加，且MK2206處理能顯著下調(diào)其磷酸化（圖6D）。由此得出，高基質(zhì)硬度能夠促進Akt對Rabin8的磷酸化激活。作者還進一步探討了Rabin8磷酸化激活Rab8的機制。結(jié)果顯示，該位點磷酸化能夠顯著促進Rab8與GDP的結(jié)合速率，反之則抑制二者結(jié)合速率，表明Akt對Rabin8的磷酸化增強了Rabin8的GTP結(jié)合速率（圖6E-F）。由于Rabin8存在自我抑制構(gòu)象，作者進一步用BRET（Bioluminescence resonance energy transfer）實驗對其進行了驗證。結(jié)果顯示，BRET比例在Akt磷酸化后顯著下調(diào)，表明Akt抑制Rabin8的自我抑制構(gòu)象的形成。由此，作者闡明了高硬度基質(zhì)培養(yǎng)條件下，Akt激活通過調(diào)控Rabin8的磷酸化，抑制其自我抑制構(gòu)象的形成，從而增強其對Rab8的激活作用。

圖6

5、Exostiff promotes tumour aggression through Notch pathway activation

由上述研究作者發(fā)現(xiàn)高硬度基質(zhì)培養(yǎng)的細胞外泌體通過FAK-Akt-Rabin8信號軸調(diào)控外泌體分泌，那么分泌的這些外泌體是否也有與之前報道一致的促腫瘤進展功能呢【5】？為此，作者用C57小鼠構(gòu)建了肝癌模型，并將不同硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞分泌的外泌體注入肝癌小鼠。結(jié)果表明，高硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞分泌的外泌體顯著促進了肝癌進展（圖7A-B）。相反，用Akt抑制劑MK2206處理高硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞所分泌的外泌體不能促進肝癌進展（圖7C）。那么外泌體是如何促進肝癌進展的呢？這就需要提到蛋白組學(xué)篩選到的另一個明顯改變的通路--Notch signaling了。

Western blotting 的結(jié)果表明，高硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞Notch信號通路組分蛋白顯著增加（圖7D）。已知Notch信號通路與肝癌進展有關(guān)【6】，作者也對二者相關(guān)性進行了驗證和確認(rèn)（圖7E-F），而在Huh7細胞內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，高硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞分泌的外泌體能上調(diào)細胞Notch信號通路組分蛋白（圖7G）。已知Notch信號通路可以通過影響腫瘤微環(huán)境促進腫瘤進展，而且Notch信號通路的激活配體Jagged1存在于外泌體【7,8】。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，高硬度基質(zhì)培養(yǎng)細胞分泌的外泌體含有更高水平的Jagged1（圖7H）。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，Jagged1與此類細胞分泌的外泌體標(biāo)志蛋白CD63和HRS（介導(dǎo)外泌體內(nèi)容物向多囊泡運輸）存在共定位（圖7I）。免疫共沉淀的結(jié)果也顯示了Jagged1和HRS的相互作用（圖7J）。上述結(jié)果表明，外泌體可能通過增加Notch信號通路激活配體Jagged1的運輸激活腫瘤細胞的Notch信號通路，從而促進腫瘤進展。

圖7

Take-home messages：

總結(jié)一下，故事的大概思路就是確定腫瘤生長微環(huán)境硬度與腫瘤細胞外泌體之間的關(guān)系→蛋白組學(xué)高通量篩選到顯著改變蛋白→基質(zhì)硬度調(diào)控目的蛋白及目的蛋白調(diào)控外泌體分泌具體的分子機制，以及外泌體調(diào)控腫瘤進展的可能機制探討。研究結(jié)論回答了研究意義中“基質(zhì)硬度如何調(diào)控腫瘤微環(huán)境-腫瘤細胞相互作用，以及該刺激如何調(diào)控外泌體分泌”的問題，但是外泌體調(diào)控腫瘤進展的具體機制論證則相對不足（第5部分的后半部分），只是進行表達相關(guān)性的分析，并沒有對應(yīng)抑制/激活相關(guān)信號通路的功能驗證，可能這也是作者Notch信號通路部分機制探索用詞比較收斂的原因。

這篇故事對我們的啟示：（1）故事的種子一定要好（基質(zhì)硬度如何通過外泌體介導(dǎo)腫瘤細胞和其微環(huán)境間的相互作用及其具體分子機制）；（2）做一個課題一定要有一套成熟的細胞/動物模型（外泌體分析模型，這是你在領(lǐng)域內(nèi)的話語權(quán)）。上述兩點對于投較好期刊（或者說過編輯這關(guān)）是非常重要的。其次，分子機制的探索仍是優(yōu)秀期刊必不可少甚至是最重要的，表型的描述固然重要，但一個故事更重要的是表型下面潛在的分子機制，即知其然更要知其所以然（雖然本文Notch部分闡述不是特別具有說服力，但Akt部分論證是十分具有說服力和翔實的）。至于如何找到有意思的分子機制，可以通過文獻和組學(xué)技術(shù)找已知分子的新下游/新修飾位點，或者利用高通量篩選找已知/未知的分子。不要拘泥于一個分子的已有研究報導(dǎo)（例如本文的Akt蛋白），我們應(yīng)該意識到：機制是張信號通路網(wǎng)，我們找到的某一個分子只是這張網(wǎng)的一個節(jié)點而已，而不同的細胞、不同的上游刺激都會改變這張網(wǎng)的布局，能用巧妙的實驗和意外的發(fā)現(xiàn)讓我們能一窺這張網(wǎng)的“冰山一角”，并讓跟進者能“順藤摸瓜”才是科研的意義和樂趣所在。

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