這期我們將主要介紹WB實驗的顯影方法和儀器
顯影?
Western Blot實驗的最后一步，是顯影。拿到高特異性、低背景的顯色圖像，將為實驗結(jié)論提供強有力的佐證。顯色的原理是實驗中的二抗被HRP（辣根過氧化物酶）標記，可采用增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）。ECL靈敏度高、重復(fù)性好，是目前主流的WB顯色方法。
顯色方法主要有以下四種：放射自顯影，增強化學(xué)發(fā)光法（ECL），酶促底物DAB顯色法和熒光二抗顯影法。
? ? ? ? 其中放射性自顯影已經(jīng)被淘汰，熒光二抗顯影法得益于凝膠成像系統(tǒng)的升級，也逐漸開始成為主流，與增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）和酶促底物DAB顯色法并列為最常用的三種顯色方法。
1. 增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）
? ? ?? ?在ECL底物中，含有H2O2和魯米諾（及其衍生物），在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光。ECL與HRP作用顯色，穩(wěn)定性好，靈敏度高，成像性好，對儀器設(shè)備無特殊要求，是目前最常用的顯影方法。
2. 酶促底物DAB顯色法
? ? ? ?DAB，3,3'-Diaminobenzidine，是HRP（辣根過氧化物酶）的常用底物，在辣根過氧化物酶的催化下，DAB與雙氧水反應(yīng)產(chǎn)生棕色沉淀，該棕色沉淀不溶于水和乙醇，因此在DAB顯色后，還可以使用溶于乙醇的染料進行后續(xù)染色。DAB和HRP作用形成褐色不溶性產(chǎn)物，靈敏度和成像性相對較差，且DAB有一定致癌性，使用時要格外注意。
3. 熒光二抗顯影法
? ? ? ?相比較于傳統(tǒng)的顯色法和化學(xué)發(fā)光法只能定性和半定量檢測一個蛋白的局限性，熒光WB不僅能在定性的同時實現(xiàn)蛋白定量，還兼容多色熒光抗體的優(yōu)越性，同時完成二個或者更多蛋白的檢測，只要有合適的熒光標記抗體就可以實現(xiàn)熒光WB甚至多色熒光WB檢測。
? ? ? ?操作上，增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）和酶促底物DAB顯色法都有成熟的商業(yè)試劑盒在售，將顯影液配置好即可進行顯影，使用非常便捷；熒光二抗顯影法無需使用顯影液，只要有合適的熒光標記抗體以及熒光檢測設(shè)備，即可進行檢測。
成像常用儀器和試劑
凝膠圖像分析系統(tǒng)
? ? ? ?ECL化學(xué)發(fā)光液的主要成分是魯米諾（luminol）及異魯米諾衍生物。魯米諾和H2O2混合后作為底物，可在HRP的作用下發(fā)熒光，利用X光片或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。
魯米諾發(fā)光示意圖
實驗步驟
1、將雜交膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀載物臺上；
2、在避光環(huán)境中，取等體積（如各取500μL）ECL試劑A液和B液，充分混合；
3、用移液器吸取適量（根據(jù)膜的大小，一般1平方厘米約100μL）混合液，均勻滴在雜交膜上，充分濕潤；
4、推入載物臺后關(guān)好門，設(shè)置曝光時間拍攝照片（曝光時可設(shè)置不同的曝光時間采集圖像，從一系列照片中選取曝光效果最佳的圖像）。
注意事項
1、采用暗室膠片曝光方法，操作需要盡量熟練，除了要把握曝光時間，還要避免位移（壓片、取片過程中膠片和雜交膜不能有移動）；保留好膠片，作為原始憑證；
2、使用化學(xué)發(fā)光成像儀采集圖像，注意采集白光下的圖像，并與發(fā)光的圖像進行融合，作為原始憑證保存。
3、高背景的原因可能是封閉不夠好，一抗?jié)舛雀撸茨r間和次數(shù)不夠，應(yīng)降低一抗?jié)舛?，增加洗膜時間和次數(shù)。
4、出現(xiàn)非特異性條帶，原因可能是一抗非特異性與蛋白結(jié)合，此種情況絕大多數(shù)是因為一抗不好，你無法判斷那一條是目的條帶。如果實在沒有更好的抗體，建議采用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個條帶是目的條帶。當然這種情況下有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y(jié)合。
5、條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈，是因為電轉(zhuǎn)中膜和膠之間存在氣泡。應(yīng)該在轉(zhuǎn)膜前去掉膜和膠之間的氣泡
6、如果條帶中間出現(xiàn)白色（反白），原因為中心部位高濃度HRP把底物消耗過快，中間部位底物消耗結(jié)束之后就不發(fā)光了，應(yīng)降低蛋白量，降低一抗和二抗的濃度。
7、如果條帶很亮且背景高，可以減少曝光時間；如果條帶很淺，則可適當增加曝光時間；
WB實驗顯影方法和儀器就講解到這里了，我們的WB實驗合集就講解到這里了，敬請期待下一個實驗合集。
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