???? Western blot顯色的方法主要有以下幾種：一、放射自顯影，二、 底物化學(xué)發(fā)光ECL，三、底物熒光ECF，四、底物DAB呈色?，F(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot顯色底物是化學(xué)發(fā)光底物，發(fā)表文章通常也是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。

ECL法檢測(cè)辣根過氧化物酶的原理是辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（lumino，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大1000倍，通過將印記放在照相底片上感光就可以檢測(cè)辣根過氧化物酶的存在。ECL法操作簡便，應(yīng)用現(xiàn)成的試劑盒，按照說明，將兩種顯色底物等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面，顯影、定影（或用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)）

ECL Western特異發(fā)光檢測(cè)試劑盒用于辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的蛋白或核酸檢測(cè)。下面以engreen的超敏型ECL發(fā)光液Enlight-Plus為例，說一下檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟。

1. 常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP 標(biāo)記抗體或核酸探針孵育、洗膜。以下操作在室溫進(jìn)行。

注意：Enlight-Plus 推薦的抗體稀釋度為:

儲(chǔ)存液濃度為1mg/ml 的一抗推薦稀釋度?儲(chǔ)存液濃度為1mg/ml 的二抗推薦稀釋度

1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml

2.新鮮配制發(fā)光工作液。將BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，制成發(fā)光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 發(fā)光工作液)。轉(zhuǎn)移到清潔的塑料小盒中。

3. 用鑷子將漂洗過的膜取出，將膜的下緣與濾紙輕輕接觸以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥。將膜轉(zhuǎn)移至有發(fā)光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，輕輕搖晃，室溫孵育幾十秒到1 分鐘。

4. 用鑷子將膜夾起5-10 秒，并將膜的下緣與濾紙輕輕接觸以除去膜上多余的發(fā)光液，迅速將膜完全包裹于潔凈保鮮膜內(nèi)，去除氣泡和褶皺，蛋白面朝上固定于X 片暗盒內(nèi)。

5. 在黑暗中一次重疊放入3 張X 光膠片，30 分鐘或更長時(shí)間后全部取出顯影。

6. 對(duì)同一張膜進(jìn)行多次蛋白雜交：用PBST 或TBST 洗滌掉發(fā)光液（10min×3 次），然后從開始一抗雜交即可。

ECL的使用注意事項(xiàng)：

1. 發(fā)光液不宜暴露于強(qiáng)光下時(shí)間過久，請(qǐng)避光保存，在暗室操作。

2. 為了得到最佳的曝光效果，優(yōu)化一抗、二抗的稀釋比例。

3. 請(qǐng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。

4. 對(duì)于Enlight發(fā)光液，應(yīng)避免使用NaN3 回收HRP 偶聯(lián)的抗體，因?yàn)镹aN3 能抑制HRP 的活性。