生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)分別是什么？在一個實驗中應(yīng)該如何安排生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)？
重復(fù)是實驗設(shè)計的重要原則之一，實驗重復(fù)無論對于實驗結(jié)果的可重復(fù)性，還是對于最終實驗結(jié)論的可靠性，都起著起決定性的作用。
實驗重復(fù)還可以進一步細分為生物重復(fù)(biological replicates)和技術(shù)重復(fù)(technical replicates)，那么生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)分別是什么？在一個實驗中應(yīng)該如何安排生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)？
生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)分別是什么？
生物重復(fù)：指對同一個處理組中獨立來源的重復(fù)樣本分別進行獨立分析，是整個實驗的完全重復(fù)，如將具有同一基因型的多個細胞株進行獨立地測定。由于遺傳和環(huán)境等因素的影響會引起有機體的個體差異，因此需要采用生物重復(fù)的實驗設(shè)計方法來消除該差異。目前都以3次生物學(xué)重復(fù)實驗設(shè)計為主，要求嚴格的實驗可以做5次重復(fù)。
技術(shù)重復(fù)：指對同一樣本進行重復(fù)地檢測分析，例如同一份細胞中抽提的蛋白質(zhì)進行三次質(zhì)譜檢測，或者對同一RNA-seq樣本測序3次。與生物學(xué)重復(fù)相比，技術(shù)重復(fù)的測量變異程度較小，從而可以減少實驗中的分析變異，將對同一份樣本產(chǎn)生高重復(fù)性的測量結(jié)果 。
簡單來講，生物重復(fù)是生物級別的重復(fù)，一般都是生物樣本的重復(fù)。而技術(shù)重復(fù)，更多的是參數(shù)測定環(huán)節(jié)的重復(fù)，一般是對同一生物樣本進行多次測定。
進一步分析，其實可以發(fā)現(xiàn)生物重復(fù)是衡量實驗的總波動的（處理組間的差異不列入此處的波動，他們應(yīng)該稱為效應(yīng)），它包括樣本個體間差異和技術(shù)重復(fù)差異，而技術(shù)重復(fù)更多的是單純的衡量參數(shù)測量時的波動，如實驗操作嫻熟程度、儀器穩(wěn)定性等等。
在一個實驗中應(yīng)該如何安排生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)？
如此說來，對于一個實驗來說，如果條件允許的話，最好把生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)做全了？
然而StatQuest推薦的策略是只需要生物重復(fù)即可，不需要技術(shù)重復(fù)。為什么？
只做生物重復(fù)
以小鼠的RNA-seq實驗為例，先看一下生物偏差（biological variation）和技術(shù)偏差（technical variation ）。
下圖代表小鼠的RNA-seq數(shù)據(jù)，虛線μ是總體小鼠的Read Counts，藍色條代表5個樣本小鼠的Read Counts。那那么樣本小鼠的Read和總體μ是存在一定的差異的，我們將5個樣本小鼠的Read取平均：
average = [(μ+5)+(μ-1)+(μ+4)+(μ+2)+(μ-5)] / 5 = μ + (5-1+4+2-5)/5
隨著生物重復(fù)的增多，(5-1+4+2-5)/5會逐漸趨向于0，這個平均數(shù)也會趨近于總體均值μ。

剛才只考慮了生物生物偏差，沒有考慮技術(shù)偏差，下圖中添加了技術(shù)偏差，棕色條為生物偏差，綠色箭頭為技術(shù)偏差，那么此時依然可以取5個樣本小鼠的Read平均：
average = μ + (5-1+4+2-5)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著生物重復(fù)的增多，生物偏差(5-1+4+2-5)/5 逐漸趨向于0，技術(shù)偏差也會逐漸趨向于0，這個平均數(shù)也會趨近于總體均值μ。
所以只做生物重復(fù)就可以很好的使用樣本代表總體。

只做技術(shù)重復(fù)
繼續(xù)進行實驗，下圖代表對1#小鼠測定了5次RNA-seq數(shù)據(jù)。那么同樣方法取5個RNA-seq數(shù)據(jù)的平均：
average = μ + 5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著技術(shù)重復(fù)數(shù)的增加，技術(shù)偏差(-2+5+2-2-1)/5會逐漸趨近于0，而這個平均數(shù)會逐漸趨近于μ + 5，永遠也不會等于總體均值μ，因此做再多的技術(shù)重復(fù)，最終的RNA-seq數(shù)據(jù)也無法很好的代表總體。

同時做生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)
以下圖為例，1#小鼠做了2個技術(shù)重復(fù)，2#小鼠做了3個技術(shù)重復(fù)，此時的生物偏差為5、5、-1、-1、-1，而技術(shù)偏差不變（技術(shù)偏差是參數(shù)測定時的偏差，不會因樣本而異，而且因樣本而已的偏差肯定是樣本偏差），所以樣本均值為：
average = μ + (5+5-1-1-1)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
隨著樣本量的增加，技術(shù)偏差(-2+5+2-2-1)/5會逐漸趨向于零。
但生物偏差(5+5-1-1-1)/5雖然也會收斂到0，但是此時所需要的樣本量比‘只做生物重復(fù)’時大大增加，也就是說生物偏差的收斂速度變慢了。

這個生物偏差收斂變慢的速度有多慢呢？
假如多了3個技術(shù)重復(fù)，那么就需要3倍的樣本量才能抵得上‘只做生物重復(fù)’時的收斂速度。說白了，就是多做的技術(shù)重復(fù)最多不過和‘只做生物重復(fù)’的效果持平而已。

做一下總結(jié)：
只做生物重復(fù)：最佳的實驗設(shè)計，可以很好的代表總體；
只做技術(shù)重復(fù)，沒有生物重復(fù)：不要使用這種實驗設(shè)計，永遠只會得到總體的有偏估計。
生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)：不推薦做，并不能很好的提高樣本的代表性，要么獲得一個有偏的估計，要么需要更多的樣本。