單細胞測序技術能夠揭示單個細胞的基因表達狀態(tài)，反映細胞間的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)新的稀有細胞類型。當前單細胞測序技術的一個限制是需要組織解離，導致空間信息的丟失。為了解決這個問題，空間轉錄組學平臺則保留了空間結構，從而允許以前所未有的深度分析腫瘤與腫瘤微環(huán)境的相互作用。
下面分享一篇在?Cancer Discovery?上發(fā)表的題為：Single-cell atlas of lineage states, tumor microenvironment and subtype-specific expression programs in gastric cancer 的研究論文。
科學問題
胃癌（GC）是導致全球癌癥發(fā)病率和死亡率的主要原因，其表現(xiàn)出高水平的患者間和患者內(nèi)的異質(zhì)性。通過前期群體測序已知每個胃腫瘤樣本都具有獨特的表達譜。然而，我們對腫瘤微環(huán)境（TME）中各細胞類型如免疫細胞、成纖維細胞等驅(qū)動 GC 表型的機制的理解仍處于初級階段。
技術方法及路線
主要結論
1、scRNA-seq 識別異質(zhì)性細胞群、細胞命運軌跡和稀有細胞群
40 個樣本的 152,423 個細胞降維，分成34 個群（圖 1B），5 種細胞大類，各細胞類型在組間占比不同（圖 1C）。漿細胞群的單細胞擬時序分析表明了漿細胞分化和成熟的不同階段（圖 1E)。此外，鑒定到一種新型稀有細胞類型 STF4。STF4 細胞群表達?PLVAP（內(nèi)皮細胞標志物）和?RGS5（成纖維細胞標志物），暗示了一種罕見的混合譜系群體（圖 1F）。作者也使用雙色 RNAScope 技術驗證了?PLVAP/RGS5?雙陽性群體的存在。STF4 細胞群可能突出顯示經(jīng)歷內(nèi)皮-間充質(zhì)轉化（EndoMT）的細胞，這是一個內(nèi)皮細胞獲得間充質(zhì)或肌成纖維細胞表型的過程。綜上，這些結果展示了 scRNA-seq 揭示異質(zhì)性細胞群、細胞命運軌跡以及稀有細胞群的能力。
2、scRNA-seq 識別胃癌細胞特異性轉錄
與正常組相比，腫瘤中上皮細胞的比例較低，骨髓細胞較高。淋巴樣、血漿和基質(zhì)細胞的比例沒有差異。與正常組織相比，腫瘤相關上皮細胞表現(xiàn)出更高致癌基因特征表達（圖 2B）。GC 癌基因（如?CEACAM6、EGFR、MET、CCND1?和KRAS?）的表達在 EpiInt1 腫瘤上皮細胞亞群上調(diào)最大（圖 2C）。與正常相比，腫瘤相關上皮細胞表現(xiàn)出顯著異常 CNV（圖 2D）。比較同一細胞類型組間（腫瘤組和正常組）差異顯示，“主要細胞”和“腸型細胞”差異最大（圖 2E）。LIPF 和 PGA3 在腫瘤中下調(diào)（圖 2F）。使用 DSP 空間轉錄組技術，作者證實了與正常樣本相比，腫瘤上皮細胞（PanCK+）中?LIPF?的下調(diào)表達（圖 2G）。成纖維細胞細分三個亞群（圖 2H）。綜上，在 GC 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中，來自上皮和腫瘤微環(huán)境的不同細胞表達不同的致癌轉錄組學特征 —— 每種特征都是不同癌癥所必需的，并最終會混合以產(chǎn)生復合腫瘤分子圖譜（圖 2I)。
3、scRNA-seq 揭示彌漫型胃癌中?KLF2?相關的漿細胞富集
與腸型 GC 相比，彌漫型 GC 中漿細胞相對比例更高，上皮細胞較低，淋巴、骨髓和基質(zhì)細胞群沒有差異（圖 3A）。使用 IRF4（漿細胞標記物）免疫組化（圖 3B）證實了彌漫型腫瘤中漿細胞水平的增加。重新分析 TCGA 中群體轉錄組數(shù)據(jù)，進一步驗證了彌漫型 GC 中漿細胞水平的增加（圖 3C）。單細胞數(shù)據(jù)表明彌漫型 GC 中漿細胞的富集主要由漿細胞簇 PL4 和 PL5 驅(qū)動（圖 3D）。KLF2?是一種先前顯示可調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤中漿細胞歸巢的基因。作者觀察到漿細胞比例與表達?KLF2?的上皮細胞之間存在顯著相關性（圖 3E）。這一發(fā)現(xiàn)表明，高表達?KLF2?的上皮細胞可能與彌漫型 GC 中的漿細胞募集有關。ChIP-seq 和群體轉錄組測序發(fā)現(xiàn)彌漫型 GC?KLF2?H3K27ac 啟動子水平和基因表達均高于腸道 GC，啟動子信號和基因表達之間具有良好的相關性。分析 TCGA 群體轉錄組測序數(shù)據(jù)進一步證實與腸型腫瘤相比，彌漫型腫瘤?KLF2?表達增加（圖 3F）。為了探索空間環(huán)境中?KLF2?的差異，作者使用 DSP 空間轉錄組技術來分析?KLF2?在上皮細胞（Pan-CK+）中的表達。結果證實與腸型上皮細胞相比，彌漫型上皮細胞中的?KLF2?轉錄水平更高（圖 3G）。此外，作者觀察到與遠端上皮細胞相比，靠近漿細胞的上皮細胞中?KLF2?表達更高（p = 0.096）（圖3H）。進一步作者通過人源化小鼠模型及細胞共培養(yǎng)體外遷移實驗證明腫瘤上皮細胞中?KLF2?表達與宿主漿細胞之間的關系（圖 3I-J）。總之，研究結果確定了彌漫型 GC 中漿細胞募集，上皮細胞?KLF2?表達作為漿細胞募集的潛在驅(qū)動因素。
4、scRNA-seq 揭示了不同的成纖維細胞亞群和?INHBA-FAP作為腫瘤成纖維細胞調(diào)節(jié)因子
作者根據(jù)臨床分期和組織學亞型比較了 scRNA-seq 中的腫瘤成纖維細胞亞群（STF1-3），結果表明三個亞群都呈階段性增加（圖 4A）。STF1 和 STF3 簇表現(xiàn)出?FAP、ACTA2、TAGLN?的上調(diào)，STF2 簇僅表現(xiàn)出?CSPG4?的上調(diào)（圖 4B）。據(jù)報道，TGF-β 超家族信號會影響其他癌癥類型中的腫瘤成纖維細胞（CAF）的功能。因此，作者選擇研究 TGF-β 通路的主要組成部分激活素-抑制素信號傳導模塊，包括 9 個經(jīng)典基因。在這 9 個基因中，與正常相比，只有?INHBA?在腫瘤相關的 STF2 和 STF3 簇中表現(xiàn)出顯著上調(diào)（圖 4C）。INHBA?與STF3 中的?FAP?呈顯著正相關，而與 STF2 中的?CSPG4?未發(fā)現(xiàn)相關性?？臻g DSP 數(shù)據(jù)分析表明?FAP?和?INHBA?在腫瘤成纖維細胞（SMA+）中的表達高于正常（圖 4D-F），并且在腫瘤成纖維細胞中?FAP?和?INHBA?共表達水平存在很強的相關性（圖 4G）。作者進一步通過體內(nèi)外系列功能實驗表明?INHBA?正調(diào)節(jié)胃癌?STF3?成纖維細胞群中?FAP?表達（圖4H-J）。研究還發(fā)現(xiàn)從正常到 IV 期 STF3 中?FAP?和?INHBA?表達增加（圖 4K）。通過?INHBA?表達水平對 TCGA 樣本進行的生存分析顯示，具有高?INHBA?表達的腫瘤樣本的生存率顯著降低（圖 4L）。
5、胃癌類器官的 scRNA-seq
為了研究與體內(nèi)原代腫瘤相比，體外類器官培養(yǎng)條件對轉錄狀態(tài)或整體細胞比例的影響，作者將來自患者類器官（PDO）的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集與原發(fā)腫瘤進行整合分成五個主要的細胞群（圖 5A）。與正常 PDO 上皮細胞相比，腫瘤 PDO 上皮細胞表現(xiàn)出癌癥相關模塊和 GC 相關基因的上調(diào)（圖 5B）。對正常和腫瘤 PDO 中上皮細胞的軌跡圖分析表明，來自腫瘤類器官的上皮細胞相對于正常上皮細胞具有多個分支，這與正在經(jīng)歷普遍和持續(xù)分化或去分化的腫瘤 PDO 上皮細胞一致（圖 5C）。研究者進一步揭示了原發(fā)腫瘤和 PDO 之間的差異（圖 5D-G）。總之，這些結果提出了一種可能性，即除了上皮細胞外，PDO 培養(yǎng)也可能影響與腫瘤相關的其他細胞類型的轉錄譜。
總結
該研究對超過 30 名具有不同亞型和階段的胃癌患者的擴展隊列進行了 scRNA-seq，跨越大量細胞（＞200,000 個細胞）生成了全面的胃癌單細胞圖譜。共鑒定到34個細胞群，包括新的稀有細胞群。觀察到彌漫型腫瘤中漿細胞比例增加，以及以高?INHBA?和?FAP?共表達為特征的癌癥相關成纖維細胞亞群的分期積累。單細胞分析比較了患者來源的類器官（PDO）和原發(fā)性腫瘤之間的相似性和差異。通過 DSP 空間轉錄組學、獨立的群體 RNA-seq 以及體外和體內(nèi)模型的功能實驗來補充這些發(fā)現(xiàn)。該研究提供了跨不同胃癌亞型的患者內(nèi)部和患者間單細胞高分辨率分子圖譜。
