環(huán)狀RNA的識(shí)別包含了序列比對(duì)和環(huán)狀RNA預(yù)測(cè)兩步，該軟件目前更新到了v2版本，相比v1版本，用法有較大變化。在v1版本中只支持tophat-fusion和STAR兩款軟件進(jìn)行序列比對(duì)來識(shí)別junction reads,在v2版本中，擴(kuò)展到了以下5種軟件
- TopHat2/TopHat-Fusion
- STAR
- BWA
- MapSplice
- segemehl
原理
- Align用于將序列比對(duì)到參考基因組上;
- Parse用于從比對(duì)結(jié)果中挑選junction reads;
- Annotate用于預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA;
- Assemble用于組裝環(huán)狀RNA的轉(zhuǎn)錄本序列；
- Denovo根據(jù)序列組裝結(jié)果，識(shí)別新的環(huán)狀RNA和分析環(huán)狀RNA上的可變剪切事件
安裝
- pip install circexplorer2
- conda install circexplorer2 --channel bioconda
該軟件分為以下5個(gè)功能模塊：
- Align：用于將序列比對(duì)到參考基因組上
- Parse：用于從比對(duì)結(jié)果中挑選junction reads
- Annotate：用于預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA
- Assemble：用于組裝環(huán)狀RNA的轉(zhuǎn)錄本序列
- Denovo：根據(jù)序列組裝結(jié)果，識(shí)別新的環(huán)狀RNA和分析環(huán)狀RNA上的可變剪切事件
使用方法
1. Align
雖然支持多款序列比對(duì)軟件，但是由于tophat的結(jié)果更方便后續(xù)的cufflinks軟件進(jìn)行分析，官方推薦使用tophat來進(jìn)行比對(duì)。針對(duì)單端序列的比對(duì)，代碼如下
CIRCexplorer2 align \
-G hg19.gtf \
-i bowtie1_index \
-j bowtie2_index \
-f RNA_seq.fastq \
> CIRCexplorer2_align.log
值得注意的是，align模塊僅提供了針對(duì)單端序列使用tophat進(jìn)行比對(duì)的功能，如果你是雙端測(cè)序的結(jié)果或者想要使用其他軟件，只能是自己手工進(jìn)行比對(duì)，這里比較推薦STAR軟件，速度較快，缺點(diǎn)就是內(nèi)存消耗較大。
2. parse
parse用于解析序列比對(duì)的結(jié)果，支持多款軟件，以常用的STAR為例，代碼如下
CIRCexplorer2 parse \
-t STAR \
Chimeric.out.junction \
> CIRCexplorer2_parse.log
對(duì)于其他軟件的用法，具體請(qǐng)參考官方文檔，無論是什么比對(duì)軟件，該命令最終都會(huì)生成以下文件
back_spliced_junction.bed
3. annotation
這一步就是根據(jù)已知的線性轉(zhuǎn)錄本信息，識(shí)別環(huán)狀RNA，所以需要提供參考基因組對(duì)應(yīng)的注釋文件，官方也提供了腳本來幫助我們下載，用法如下
fetch_ucsc.py hg19 ref hg19_ref.txt
預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA的代碼如下
CIRCexplorer2 annotate \
-r hg19_ref.txt \
-g hg19.fa \
-b back_spliced_junction.bed \
-o circularRNA_known.txt \
> CIRCexplorer2_annotate.log
-o參數(shù)為輸出結(jié)果，內(nèi)容示意如下
每列的含義如下所示
如果你只是想要使用這個(gè)軟件來預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA,那么多款序列比對(duì)軟件都可以選擇，但是你想要使用完整功能，則必須使用tophat來進(jìn)行比對(duì)。
參考資料：
