今天給大家介紹一篇 2023 年發(fā)表在 Journal of Chemical Information and Modeling 上的文章, 標(biāo)題為:《A Combined Ligand- and Structure-Based Virtual Screening To Identify Novel NaV1.2 Blockers: In Vitro Patch Clamp Validation and In Vivo Anticonvulsant Activity》。

導(dǎo)讀

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特征為大腦異常電活動(dòng)引發(fā)的反復(fù)發(fā)作。電壓門(mén)控型鈉通道（NaVs）在神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏钠鹗己蛡鞑ブ邪缪蓐P(guān)鍵角色，對(duì)癲癇的發(fā)病機(jī)理至關(guān)重要。

本研究的目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)能夠與 NaVs 互作的潛在抗癲癇化合物，尤其是大腦亞型 hNaV1.2。

研究者構(gòu)建了基于配體的 QSAR 模型和基于結(jié)構(gòu)的分子對(duì)接模型，并在 DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行了并行虛擬篩選。選定了 Montelukast、Novobiocin 和 Cinnarizine 進(jìn)行體外測(cè)試，結(jié)果證實(shí)這些化合物能夠抑制 HEK293 細(xì)胞中異源表達(dá)的 hNaV1.2 通道。其中兩種化合物在 GASH/Sal 音頻誘發(fā)癲癇模型中進(jìn)行了評(píng)估，顯示出降低聲音誘發(fā)性癲癇發(fā)作的潛力。

數(shù)據(jù)獲取與整理

數(shù)據(jù)來(lái)源與選擇標(biāo)準(zhǔn)

本研究的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)來(lái)源于 ChEMBL30 數(shù)據(jù)庫(kù)，特別關(guān)注在 BTX 置換實(shí)驗(yàn)中評(píng)估的化合物。BTX 源自 Phyllobates 蛙類(lèi)，因其對(duì) NaVs 的影響而被視為理解這些通道的關(guān)鍵組成。

核心數(shù)據(jù)集

整理了一個(gè)僅包含在 Rattus norvegicus 腦組織中確定 IC50 測(cè)定的核心數(shù)據(jù)集。對(duì)具有多個(gè) IC50 值的化合物，計(jì)算了 pIC50 的中位數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)差。

方法

SOMoC 聚類(lèi)

通過(guò) Silhouette Optimized Molecular Clustering (SOMoC) 方法對(duì)分子進(jìn)行了聚類(lèi)。這種方法結(jié)合了分子指紋識(shí)別、UMAP 降維和高斯混合模型聚類(lèi)。隨后，將數(shù)據(jù)集劃分為訓(xùn)練集（80%）和測(cè)試集（20%）。

擴(kuò)展的分類(lèi)數(shù)據(jù)集

擴(kuò)展數(shù)據(jù)集包括具有 IC50、Ki 的化合物。這個(gè)數(shù)據(jù)集與核心集相比，不那么同質(zhì)化，用于評(píng)估模型作為二分類(lèi)器的表現(xiàn)。

QSAR 模型

降維

首先使用 Mordred 軟件包計(jì)算了 1613 個(gè)分子描述符。然后進(jìn)行了兩步降維過(guò)程，過(guò)濾掉低方差和高度相關(guān)的描述符。

特征選擇和機(jī)器學(xué)習(xí)模型

遺傳算法優(yōu)化了一組解決方案，最小化損失指標(biāo)。選取前 25 個(gè)特征進(jìn)行機(jī)器學(xué)習(xí)模型的訓(xùn)練，保持平衡以避免過(guò)擬合。

超參數(shù)調(diào)整與模型驗(yàn)證

調(diào)整方法

采用了 Tree-of-ParzenEstimators 算法的貝葉斯方法來(lái)優(yōu)化超參數(shù)，重點(diǎn)是最小化過(guò)擬合。

驗(yàn)證

模型經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的內(nèi)部和外部驗(yàn)證，包括 10 折交叉驗(yàn)證（CV）和使用模擬數(shù)據(jù)庫(kù)的回顧性虛擬篩選（VS）活動(dòng)。

對(duì)接

結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備與對(duì)接

優(yōu)化了 hNaV1.2 通道的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并用于對(duì)接研究。使用不同的算法進(jìn)行了對(duì)接，用不同的評(píng)分函數(shù)重新評(píng)分了復(fù)合物。

評(píng)估

使用 Kendall’s Tau_B 等指標(biāo)評(píng)估了模型的性能，確保了可靠和準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。

分析 Na+電流

細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)設(shè)置

在 HEK293 細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用膜片鉗技術(shù)記錄 Na+電流。

GASH/Sal 模型

采用 GASH/Sal 倉(cāng)鼠模型進(jìn)行體內(nèi)抗癲癇活性測(cè)試。

結(jié)果總結(jié)

1. 數(shù)據(jù)獲取與整理：分析了 322 種化合物的 pIC50 值，采用 SOMoC 方法進(jìn)行聚類(lèi)，劃分為五個(gè)類(lèi)別，每個(gè)類(lèi)別特征均勻分布。
2. 特征選擇與模型開(kāi)發(fā)：從 1613 個(gè)描述符中篩選出 203 個(gè)，通過(guò)遺傳算法進(jìn)行特征選擇。對(duì)八種機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行評(píng)估，最終選擇 SGD、SVR 和 LGBM 進(jìn)行深入研究。
3. 超參數(shù)調(diào)優(yōu)：對(duì)選中算法進(jìn)行 5000 次貝葉斯優(yōu)化，優(yōu)化 TauB 排名相關(guān)系數(shù)。
4. 模型驗(yàn)證與比較：執(zhí)行內(nèi)部和外部驗(yàn)證，比較不同模型的性能。在二分類(lèi)模型中，LGBM 表現(xiàn)最為出色。
5. 虛擬篩選與藥物篩選：在 DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行虛擬篩選，識(shí)別出如 MTK、NVB 和 CNZ 等潛在藥物候選物。

圖 1：數(shù)據(jù)集組成

圖 2：遺傳算法特征選擇步驟的示意圖

圖 3：使用 SOMoC 進(jìn)行核心數(shù)據(jù)集聚類(lèi)

• (a) 展示了選擇數(shù)據(jù)中最佳聚類(lèi)數(shù)的 Silhouette 值與 K 值對(duì)比。
• (b) 當(dāng) K=5 時(shí)，各聚類(lèi)的 Silhouette 系數(shù)分布，紅色虛線表示所有聚類(lèi)的平均 Silhouette 值。

圖 4：模型比較

圖 5：LGBM 的貝葉斯優(yōu)化

圖 6：QSAR 模型的驗(yàn)證

圖 8：相關(guān)性分析

散點(diǎn)圖展示了最佳 QSAR 和分子對(duì)接模型對(duì)核心（左側(cè)）和分類(lèi)（右側(cè)）數(shù)據(jù)集的預(yù)測(cè)效果。訓(xùn)練集和測(cè)試集中的化合物以不同顏色標(biāo)識(shí)。實(shí)線代表數(shù)據(jù)的線性回歸趨勢(shì)，

圖表 9：hNaV1.2 模型中的靶標(biāo)對(duì)接

圖示展示了三種化合物：MTK（綠色），NVB（紅色），以及 CNZ（藍(lán)色）在 hNaV1.2 模型通道孔道內(nèi)的預(yù)測(cè)構(gòu)象，以表面形式呈現(xiàn)。下方圖表展示了每個(gè)化合物的 2D 相互作用圖，揭示其化學(xué)結(jié)構(gòu)及與靶標(biāo)殘基的相互作用。疏水相互作用以實(shí)心綠線表示，π-堆疊相互作用則以綠色點(diǎn)狀虛線顯示。氫鍵由黑色虛線標(biāo)示。此外，還展示了每個(gè)靶標(biāo)的 QSAR pIC50 和分子對(duì)接分?jǐn)?shù)預(yù)測(cè)。

圖表 10：hNaV1.2 電流抑制

顯示了 hNaV1.2 通道介導(dǎo)的電流在對(duì)照條件及 1 和 10 微摩爾藥物灌注后的典型跡象。底部圖示展示了藥物灌注前后各化合物的 h 曲線變化。中間圖表比較了不同藥物和濃度下計(jì)算得到的 ΔV1/2，而底部的條形圖則顯示了電壓依賴性抑制。

星號(hào)（*）標(biāo)示與 0%抑制在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同（p < 0.05），井號(hào)（#）標(biāo)示 1 和 10 微摩爾抑制差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著（p < 0.05），和號(hào)（&）表示與 ?130 毫伏抑制在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同（p < 0.05）。

表格 1 QSAR 模型作為二元分類(lèi)器的外部驗(yàn)證

表格 2 GASH/Sal 聲誘模型中的體內(nèi)抗癲癇活性藥物

討論

本研究首先開(kāi)發(fā)了一個(gè) QSAR 模型，該模型能預(yù)測(cè)化合物在 BTX 置換實(shí)驗(yàn)中的 pIC50 值。這一模型的開(kāi)發(fā)結(jié)合了多步降維方法和多種機(jī)器學(xué)習(xí)算法的系統(tǒng)探索，以及貝葉斯方法的超參數(shù)優(yōu)化，從而提高了預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)健性。此外，變量重要性分析揭示了與靶標(biāo)互作的選擇性命中分子的若干分子決定因素，這對(duì)進(jìn)一步的藥物化學(xué)努力具有重要意義，有助于合理設(shè)計(jì)或優(yōu)化新型 NaVs 抑制劑。

在基于結(jié)構(gòu)的模型方面，通過(guò)對(duì)多種對(duì)接條件的系統(tǒng)探索，顯著提高了最終模型的評(píng)分能力。利用 Rosetta 采樣實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)周?chē)臉?gòu)象集合，我們獲得了高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)模型，在對(duì)接驗(yàn)證中，許多模型的表現(xiàn)甚至優(yōu)于原始構(gòu)象。此外，包括使用替代評(píng)分函數(shù)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行靈活重評(píng)分的后處理方法也提高了模型的評(píng)分性能，相比于基線的普通對(duì)接。

作者的目標(biāo)是將 NaV 通道抑制劑（一種經(jīng)典的抗癲癇藥物機(jī)制）與一個(gè)新靶點(diǎn) TRPV1 通道結(jié)合。關(guān)于后者，越來(lái)越多的科學(xué)證據(jù)支持調(diào)節(jié)此靶點(diǎn)作為開(kāi)發(fā)新型抗癲癇藥物的策略。此外，選擇這兩個(gè)靶點(diǎn)尋找新的抗癲癇化合物有機(jī)械性原理上的理由，因?yàn)樗鼈冊(cè)诎d癇的病理生理學(xué)中可能具有不同但高度互補(bǔ)的作用。

研究最近報(bào)道，MTK、NVB 和 CNZ 在納摩爾濃度下抑制 TRPV1 通道。此外，對(duì)于 MTK 和 NVB，抑制作用是電壓依賴性的，在負(fù)膜電位下更為顯著。貼片鉗技術(shù)記錄證實(shí)了這三種命中化合物對(duì)異源表達(dá)在 HEK293 細(xì)胞中的 hNaV1.2 通道的預(yù)測(cè)抑制活性。MTK 和 CNZ 是最有效的阻斷劑，而對(duì)于 NVB，僅在較高濃度下（10 μM）觀察到 h 曲線協(xié)議上的小效應(yīng)。抑制作用是狀態(tài)依賴性的，這與作用于位于通道孔內(nèi)的 2 號(hào)位點(diǎn)的小分子的機(jī)制一致。觀察到的電壓依賴性抑制是針對(duì) NaVs 的抗癲癇藥物的常見(jiàn)藥理特性，因?yàn)樗谀れo息電位更正的更易興奮的神經(jīng)元中產(chǎn)生更高的阻斷。

在體內(nèi)抗癲癇活性評(píng)估方面，MTK 和 NVB 在 GASH/Sal 模型中減少了聲音誘發(fā)性癲癇的嚴(yán)重程度，在所有測(cè)試劑量下均有效。此外，這些多靶點(diǎn)藥物在其他動(dòng)物模型中表現(xiàn)出有前景的抗癲癇活性，例如最大電休克發(fā)作（MES）和戊四氮（PTZ）測(cè)試?？紤]到在癲癇發(fā)生中涉及的不同機(jī)制和途徑，不同測(cè)試中的活性信息有助于表征化合物的抗癲癇剖面。與 MES 和 PTZ 模型不同，GASH/Sal 測(cè)試涉及發(fā)展了癲癇大腦并天生易于聲音誘發(fā)性癲癇的動(dòng)物，這代表了一個(gè)更真實(shí)的癲癇模型。這一結(jié)果補(bǔ)充了之前的知識(shí)，并提供了關(guān)于化合物根據(jù)癲癇類(lèi)型和與現(xiàn)有抗癲癇藥物的兼容性的潛在用途的信息。這項(xiàng)研究的結(jié)果支持了聯(lián)合調(diào)節(jié) TRPV1 和 NaV1.2 通道可能是在癲癇背景下發(fā)現(xiàn)新型多靶點(diǎn)藥物的有前景策略的假設(shè)，盡管在所報(bào)告候選物的抗癲癇活性中可能涉及其他靶點(diǎn)和機(jī)制。

• Llanos, M. A., Enrique, N., Esteban-López, V., Scioli-Montoto, S., Sánchez-Benito, D., Ruiz, M. E., Milesi, V., López, D. E., Talevi, A., Martín, P., & Gavernet, L. (2023). A Combined Ligand- and Structure-Based Virtual Screening To Identify Novel NaV1.2 Blockers: In Vitro Patch Clamp Validation and In Vivo Anticonvulsant Activity. Journal of Chemical Information and Modeling, 63(22), 7083–7096. https://doi.org/10.1021/acs.jcim.3c00645

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