腫瘤來源的維甲酸調(diào)節(jié)瘤內(nèi)單核細胞的分化以促進免疫抑制
文獻概述
研究背景介紹
在腫瘤免疫中，抗原提呈細胞（antigen presenting cells ，APCs)通過捕獲腫瘤抗原，對抗原進行加工處理，以抗原肽-MHC復(fù)合物的形式提呈給T 細胞使其活化，活化的腫瘤特異性抗原的效應(yīng)T細胞通過血管遷移并浸潤到腫瘤組織中來殺傷腫瘤細胞，從而產(chǎn)生新的抗原再次被APCs捕獲，如此循環(huán)往復(fù)（immunity，2013；39, 1–10）。其中，樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）和刺激性腫瘤相關(guān)的巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）主要促進T細胞的抗腫瘤功能，而免疫抑制性腫瘤相關(guān)的巨噬細胞主要抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進腫瘤進展。然而，有研究表明腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）能夠促進抑制性TAMs的產(chǎn)生而抑制DCs的功能，從而阻礙功能性抗腫瘤T細胞的產(chǎn)生和維持。因此，確定APCs在TME中的分化機制對于開發(fā)新的腫瘤免疫治療方法尤為重要。
巨噬細胞主要是由胚胎前體細胞或循環(huán)單核細胞分化而成。DC來源于多能造血干細胞，主要分為髓系DC和淋巴系DC。在髓系DC中，髓樣干細胞分化而來的DC稱為經(jīng)典DC（conventional DCs，cDC），而循環(huán)單核細胞分化而來的DC成為單核細胞來源的DC（monocyte-derived DCs，moDCs）。DCs作為激發(fā)機體抗腫瘤免疫的最重要的APC，能夠加工與處理腫瘤相關(guān)抗原及腫瘤特異性抗原，激發(fā)強大而持久的腫瘤抗原特異性的CD4+及CD8+ T細胞反應(yīng)。但是moDCs在抗腫瘤過程中作用尚不清楚。在實體瘤中，TME中單核細胞更傾向分化為抑制性TAMs，這種偏倚性還需要進一步研究。
維甲酸(retinoic acid，RA)是由維生素a衍生物視黃醇通過一系列酶催化生成的，其中視黃醇脫氫酶（retinaldehyde dehydrogenases，Raldh）作為RA生成的限速酶能夠催化視黃醇變成RA。許多研究表明RA可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，提高癌細胞對化療藥物的敏感性，臨床上常用來治療急性早幼粒細胞白血病。RA也在免疫耐受中發(fā)揮重要作用，一些研究認為RA能夠促進DC分化，但也有些研究表明RA可以誘導(dǎo)Foxp3+Treg和Arg+的抑炎性巨噬細胞。還有報道稱RA能夠促進Th1或Th17細胞應(yīng)答，阻礙髓系來源的抑制性細胞的功能。不同的實驗因素導(dǎo)致了這些矛盾的結(jié)果。由于TME中細胞組成的復(fù)雜性，RA在其中扮演什么角色呢？
賓夕法尼亞大學(xué)Malay Haldar課題組在本研究中打破了RA作為抗腫瘤劑這一范式，他們利用肉瘤模型發(fā)現(xiàn)TME中的IL-13能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生RA，RA通過抑制促進DC分化的轉(zhuǎn)錄因子IRF4的表達使腫瘤內(nèi)單核細胞向抑制性TAMs分化，從而促進腫瘤發(fā)展。
主要發(fā)現(xiàn)
- 腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生RA。
- RA使單核細胞向巨噬細胞而不是向DC分化。
- 阻斷RA的產(chǎn)生可增強抗腫瘤T細胞免疫力。
- 藥理阻斷RA信號可以增強抗PD-1療法的效果。
專家點評
邏輯亮點：作者從肉瘤模型中TAMs比例明顯高于DCs這一有趣的現(xiàn)象出發(fā)，利用遺傳譜系示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)TME能夠促進單核細胞向抑制性TAMs極化；通過TAMs的基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，TAMs表達高水平的維甲酸結(jié)合蛋白（retinoic acid binding proteins，CRABPs），而TME中確實有大量的RA，并且這些RA主要來源于腫瘤細胞。經(jīng)過進一步研究發(fā)現(xiàn)，RA可以調(diào)控瘤內(nèi)單核細胞的分化方向，使其分化為抑制性TAMs，而抑制其向DCs的分化。當(dāng)減少RA的產(chǎn)生或者阻斷RA-RAR信號軸時，TME中APCs產(chǎn)生更多的免疫刺激性分子，提高了T細胞的抗腫瘤應(yīng)答和抗PD-1療法治療腫瘤的效果。
由于RA常用來預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)，這一新的發(fā)現(xiàn)打破了RA作為一種抗腫瘤劑的固有認識，也為部分患者用藥后效果不佳提供了新的理論解釋。本篇研究也進一步為TME中APCs的分化和腫瘤免疫抑制環(huán)境的塑造提供了新的見解，為腫瘤免疫治療提供一個新的臨床思路。
可借鑒之處
這篇研究雖然思路比較簡單，作者論證的方法卻十分巧妙。研究腫瘤微環(huán)境中單核細胞的極化方向時，作者用遺傳譜系示蹤技術(shù)標記單核細胞（tdTom）和樹突狀細胞（GFP），將帶有熒光標記的單核細胞分離出來之后回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi)，從腫瘤中分離出來tdTom陽性的細胞進一步分析其分化方向，有力證明了腫瘤微環(huán)境中單核細胞更傾向分化為抑制性TAMs；在證明TME能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生RA時，作者將分泌RA的Aldh+腫瘤細胞和不分泌Aldh-腫瘤細胞從腫瘤中分離出來，發(fā)現(xiàn)Aldh+腫瘤細胞體外培養(yǎng)時并不能分泌RA，而將Aldh-腫瘤細胞接種到小鼠身上，發(fā)現(xiàn)Aldh-腫瘤細胞也能夠分泌RA。最后作者從TCGA數(shù)據(jù)庫中病人的樣本中進一步論證了RA和抑制性免疫微環(huán)境的相關(guān)性，提升了這項研究的臨床意義。這些都非常值借鑒。，
進一步研究的問題
RA能夠抑制IRF4的表達來抑制單核細胞向DC的分化，那么RA促進TAMs分化的具體機制又是什么呢？是否能夠利用這些機制發(fā)展出更好的方法來靶向抑制TAMs分化呢？
值得探討的問題
既然瘤內(nèi)T細胞分泌的IL-13能夠作用于腫瘤細胞，促進RA的產(chǎn)生，而RA又能夠促進腫瘤進展，那么作者為什么不使用抗IL-13的抗體看看能否減緩腫瘤進展呢？
圖片解析
腫瘤微環(huán)境中單核細胞的分化情況？
在肉瘤模型發(fā)現(xiàn)TME中，單核細胞（CD45+CD11b+Ly6C+）和TAMs（CD45+CD11b+F4/80+Ly6C-）占據(jù)了白細胞的大多數(shù)(A)，而DCs（CD45+ZBTB46+）卻很少(B)。將這三種細胞分離出來，體外和T細胞共孵育發(fā)現(xiàn)，TAMs極大地抑制了T細胞增殖（C，D），而DCs能夠促進T細胞增殖（E）。利用譜系示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)單核細胞向TAMs方向分化(F，G，H)。體外分離TME中的單核細胞進行誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)這些單核細胞也能分化成DC (I，J)，所以猜測是腫瘤微環(huán)境中的某些因素抑制瘤內(nèi)單核細胞向DCs分化，促進其向TAMs分化。
結(jié)論1：TME能夠促進單核細胞向抑制性TAMs分化。
哪些因素驅(qū)動瘤內(nèi)單核細胞向TAMs分化呢？
通過分析TAMs的基因表達譜發(fā)現(xiàn)，TAMs細胞表達更高的視黃酸結(jié)合蛋白（ CRABPs） （A），腫瘤組織也有更高的Raldh表達（B）。然后，用液相色譜/質(zhì)譜檢測肉瘤模型中RA的主要生物活性亞型反式維甲酸（ATRA）含量均高于正常間質(zhì)組織(C)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RA主要來源于腫瘤細胞（D），而且不同的肉瘤類型Raldh的三種亞型表達水平也不一樣（E）。但在體外培養(yǎng)時，腫瘤細胞系幾乎不表達Raldh，而在腫瘤組織卻高表達（F）。所以猜測TME中某些因素導(dǎo)致RA的分泌。為了證實這一猜想，將腫瘤組織中 Aldh+的腫瘤細胞（即表達Raldh的腫瘤細胞）和Aldh-的腫瘤細胞（即不表達Raldh的細胞）分離出來體外培養(yǎng)一段時間（G），發(fā)現(xiàn)表達Raldh的腫瘤細胞體外培養(yǎng)時停止了RA的產(chǎn)生（H），當(dāng)把這兩種細胞重新接種到小鼠身上（G），發(fā)現(xiàn)體內(nèi)兩種細胞株表達的Aldh并沒有差別（I）。那么究竟TME中什么因素誘導(dǎo)Aldh的表達呢？通過測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)表達Aldh的腫瘤細胞表達更高的IL13Rα2 (J)。由于IL13Rα2能夠被IL-13信號誘導(dǎo)表達，體外用IL-13刺激肉瘤細胞發(fā)現(xiàn)，Raldh 3表達明顯升高(K)。當(dāng)敲除IL13Rα1時，IL-13刺激并不能上調(diào)IL13Rα2和Raldh3的表達（L）。移植敲除IL13Rα1的腫瘤細胞株成瘤后也發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中Raldh3的表達下降（M）。
結(jié)論2：TME中IL-13能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生更多的RA。
腫瘤微環(huán)境中的RA是怎么影響單核細胞分化的？
體外培養(yǎng)條件下，RA能夠抑制單核細胞向DC分化(A,B)，促進單核細胞向TAMs分化(D，E)。使用RAR的激動劑CH55也能夠抑制DCs的分化，其拮抗劑BMS493能夠抵消RA的作用（C）。RA對腫瘤來源的單核細胞也有同樣的作用（F，G）。有趣的是，在RA刺激下，單核細胞來源的APCs和TAMs抑制功能也隨之增強（H，I，J）。微陣列基因表達譜分析，RA處理細胞后，和巨噬細胞分化相關(guān)的基因表達上調(diào)，而和DC分化相關(guān)的基因表達下調(diào)(K，L)。因為RA能夠下調(diào)IRF4的表達，之前有研究表明，單核細胞向DCs分化需要IRF4參與，所以RA可能通過抑制IRF4的表達進而抑制單核細胞向DCs分化。通過使用RA的激動劑CH55或抑制劑BMS493，證實了這一猜想（M，N）。與RA刺激野生型小鼠來源的APCs作用類似，當(dāng)IRF4敲除后，T細胞的增殖也受到抑制（O）。過表達IRF4后，RA抑制DCs分化的作用也隨之消失（P）。
結(jié)論3：RA在體外能夠促進單核細胞向抑制性TAMs分化，抑制其向DCs分化。
RA能夠影響DCs的分化，阻斷RA分泌或其信號通路對腫瘤浸潤的免疫細胞有什么影響？
由于Raldh3敲除后，Raldh1表達水平會代償性增加，所以作者構(gòu)建了Raldh1/3雙敲除的小鼠（DKO）阻斷RA的分泌。與對照組相比，DKO小鼠瘤內(nèi)TAMs比例明顯下降（A），而CD11b+ DC的比例明顯上升（B）。在DKO小鼠瘤內(nèi)相當(dāng)一部分F4/80+ TAMs表達CD11c和MHCII分子。為了進一步明確RA引起腫瘤內(nèi)白細胞的變化，用單細胞測序技術(shù)比較了DKO荷瘤鼠和正常荷瘤鼠腫瘤浸潤的CD45+細胞發(fā)現(xiàn)（D），瘤內(nèi)髓系來源的細胞具有較大差異，DKO小鼠瘤內(nèi)髓系來源的細胞具有高比例的DCs（E，F(xiàn)）。進一步分析TAM發(fā)現(xiàn)，DKO小鼠瘤內(nèi)TAM表達更少的免疫抑制性分子（TAM1），更多的免疫刺激性分子（TAM2）（F，G）。當(dāng)DKO荷瘤鼠來源的TAMs和T細胞共孵育發(fā)現(xiàn)，TAMs抑制T細胞增殖的能力明顯下降（H）。但血液中白細胞和單核細胞的比例并沒有明顯變化，說明減少腫瘤細胞分泌RA對免疫應(yīng)答的影響局限于免疫微環(huán)境（I）。分析TIL發(fā)現(xiàn)，DKO荷瘤鼠TIL中CD4+T細胞比例明顯上升(J)，T細胞分泌IFN-γ的能力也明顯提高（K)。
結(jié)論4：減少腫瘤細胞分泌RA能夠增強瘤內(nèi)刺激性APCs的產(chǎn)生
既然RA能夠影響免疫應(yīng)答，那么減少RA分泌能增強抗腫瘤效果嗎？
與對照組相比，DKO荷瘤鼠腫瘤體積明顯減小，生存期明顯延長(A，B)。當(dāng)在DKO腫瘤細胞株中過表達Raldh2修復(fù)RA的產(chǎn)生時，腫瘤生長恢復(fù)對照組水平（C），而且瘤內(nèi)髓系來源的細胞表達更多的刺激性分子（D）。剔除CD4+或CD8+T細胞后，腫瘤快速生長，也進一步證明了T細胞在這個過程中的作用（E）。在Batf3-/ -小鼠中（cDC1s缺失），DKO腫瘤也迅速增長，證明了RA減少所引起的抗腫瘤效應(yīng)需要cDC1s的參與（F）。當(dāng)接種過表達OVA肽段的DKO腫瘤細胞株時，荷瘤鼠脾臟中腫瘤特異性的CD8+ T細胞的比例也明顯上升（G）。如果同時給予免疫檢查點PD-1阻抗劑則顯示出明顯的抗腫瘤協(xié)同作用(H，I)，并且聯(lián)合治療組中完全消退的小鼠能夠持續(xù)抵抗該細胞株，而對其他腫瘤細胞株沒有抵抗作用（J）。當(dāng)在正常C57小鼠一側(cè)注射DKO腫瘤細胞株一側(cè)注射正常對照腫瘤細胞株時發(fā)現(xiàn)，RA分泌的減少也能提高對側(cè)腫瘤對抗PD-l治療的敏感性（K，L，M）。
結(jié)論：減少腫瘤分泌的RA能夠提高T細胞的抗腫瘤應(yīng)答，并且增強抗PD-1療法的效果。
體內(nèi)阻斷RAR信號對腫瘤免疫應(yīng)答的影響是否和阻斷RA產(chǎn)生的效果一致呢？
當(dāng)用藥物BMS493阻斷RA-RAR這個信號軸的時候，荷瘤小鼠瘤內(nèi)TAMs比例明顯降低（A），APCs表達更多的活化型marker（B），T細胞比例也隨之提高（C）。有趣的是，在肉瘤模型中BMS493治療也能提高抗PD1療法的效果（E），但是由于B16F10不分泌RA，該腫瘤模型中BMS493治療并沒有效果，也不能提高該腫瘤對抗PD-1療法的應(yīng)答（F）。在自發(fā)肉瘤模型中，BMS493治療也能提高瘤內(nèi)刺激性髓系來源的細胞和T細胞的比例，并且TAMs表面傾向于高表達一些免疫刺激性分子（G，H）。BMS493刺激LysMCre：Rosa26tdT小鼠來源的骨髓單核細胞回輸?shù)酵吹腇S腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，腫瘤微環(huán)境中回輸?shù)膯魏思毎艽笠徊糠址只闪薈D11c+ MHCII+ DCs（I），而且回輸BMS493刺激后的單核細胞腫瘤生長明顯減慢（J），TME中有更高比例活化型的APCs和殺傷作用的T細胞（K）。
結(jié)論6：體內(nèi)抑制RAR信號能夠增加TME中刺激性APCs的數(shù)量，并且能夠協(xié)同抗PD-1抗體治療腫瘤。
這一發(fā)現(xiàn)有什么臨床意義？
首先，作者評估臨床上肉瘤病人的樣本，發(fā)現(xiàn)病人的腫瘤組織確實高表達RALDH(A)，而且主要是CD45-的細胞表達（B，C）。當(dāng)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中的肉瘤病人數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，RA在一些肉瘤亞型中存在富集，主要包括STLMS、ULMS、SS(D)。在DDLPS、UPS和MFS中RA富集評分更高(E)。在多種腫瘤細胞中，RA的富集評分和RALDH3的表達成正相關(guān)，一些TGF-β和IL-10信號通路相關(guān)的免疫抑制分子也和RA的富集分數(shù)呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性（F）。
結(jié)論：臨床中，RA的富集評分與抑制性腫瘤微環(huán)境成有一定相關(guān)性。
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