為什么要檢測(cè) DNA 甲基化？首先，我們?yōu)槭裁匆獧z測(cè) DNA 甲基化呢？檢測(cè) DNA 甲基化能回答什么問題？我們都知道，DNA 甲基化可以調(diào)控基因表達(dá)，因此檢測(cè) DNA 甲基化至少可以為解釋基因表達(dá)的調(diào)控提供一些線索。其次，DNA 甲基化參與一系列重要生物學(xué)過程，包括早期胚胎發(fā)育、基因組印記、X 染色體失活、重復(fù)序列的沉默以及癌癥的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移，DNA 甲基化也有助于闡明這些重要的生命過程背后隱藏的奧秘。此外，DNA 甲基化一個(gè)非常重要的應(yīng)用，是可以作為腫瘤的生物標(biāo)志物。DNA 甲基化如此重要，我們可能需要時(shí)刻想著它。
圖 2. 人類基因組中 DNA 甲基化概況
位點(diǎn)特異性的 DNA 甲基化剛才我們介紹了總體 DNA 甲基化水平的檢測(cè)，但是這些方法都沒有提供序列信息。如果我們需要知道位點(diǎn)特異性的甲基化信息，這個(gè)時(shí)候需要問第二個(gè)問題，我是只檢測(cè)感興趣的幾個(gè)基因就行了，還是需要知道全基因組每一個(gè)基因的甲基化狀態(tài)。如果我們只需要檢測(cè)特定基因的 DNA 甲基化狀態(tài)，緊接著，我們需要問第三個(gè)問題，我們只是定性地看看甲基化狀態(tài)，還是定量地看甲基化的水平。
圖 13. 四個(gè)問題 2.0 版本之第二、三個(gè)問題Methylation-specific PCR，MSP如果只是定性地看甲基化的狀態(tài)，最簡(jiǎn)單快捷的是甲基化特異性的 PCR。MSP 可以快速檢測(cè) CpG 島中任意一組 CpG 位點(diǎn)的 DNA 甲基化狀態(tài)。
圖 14. MSP 檢測(cè) DNA 甲基化的原理[6]（圖片來源：https://www.mgmed.com/）首先抽提 DNA，進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，未甲基化的 C 轉(zhuǎn)變?yōu)?U，隨后用兩對(duì)引物進(jìn)行 PCR，一對(duì)引物是甲基化特異性的引物，可以結(jié)合甲基化的 DNA，另一對(duì)可以特異性結(jié)合未甲基化的 DNA。如果一開始被甲基化了，那么利用甲基化特異性的引物可以擴(kuò)增出來；如果一開始呈現(xiàn)未甲基化狀態(tài)，那么使用特異性結(jié)合未甲基化的引物可以擴(kuò)增出來；隨后通過瓊脂糖凝膠電泳即可檢測(cè)。我們可以看到，這里最關(guān)鍵的是針對(duì)特定的區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì) PCR 引物，我們可以借助 Methprimer 網(wǎng)站（http://www.urogene.org/methprimer/）設(shè)計(jì)甲基化的引物；MSP 最大的優(yōu)勢(shì)是，非常簡(jiǎn)單和快速，你只需要有一臺(tái) PCR 儀就可以進(jìn)行了，但是最大的局限在于你每次可能只能檢測(cè)一兩個(gè) CpG 位點(diǎn)。MethyLight當(dāng)然，我們還可以選用基于熒光的方法，比如 MethyLight。比如在甲基化特異性的引物的 5’ 端偶聯(lián)上 FAM 的熒光團(tuán)，而在未甲基化特異性的引物的 5’ 端偶聯(lián)上另一種熒光團(tuán) VIC，在 real-time PCR 過程中，會(huì)不斷釋放 FAM 和 VIC，通過檢測(cè) FAM 和 VIC，來鑒定甲基化的狀態(tài)；通過測(cè)定 Ct 值，對(duì)甲基化進(jìn)行定量。對(duì)于每個(gè) PCR 反應(yīng)而言，模板量小于 100 ng 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的 DNA。
圖 15. MethyLight 的工作原理（圖片來源：QIAGEN, EpiTect MethyLight PCR Kit）Bisulfite cloning & SequencingMSP 和 MethyLight 都是簡(jiǎn)單快速的方法，都需要借助甲基化的引物。對(duì)于檢測(cè)特定基因的甲基化，最常用的可能是重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化&克隆測(cè)序（Bisulfite cloning & Sequencing）。首先針對(duì)特定的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，隨后用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，接著用重亞硫酸鹽處理，PCR，挑克隆測(cè)序。這里推薦一些引物設(shè)計(jì)過程中可能需要用到的軟件或網(wǎng)址，包括如何尋找 CpG 島，如何設(shè)計(jì)甲基化的引物等。通常，結(jié)果呈現(xiàn)是如圖 16（右下）。
圖 16. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化&克隆測(cè)序[7]
基于高通量測(cè)序的全基因組 DNA 甲基化檢測(cè)方法接下來，我們看一下第四個(gè)問題的另一種答案，我們用高通量測(cè)序來檢測(cè)全基因組的 DNA 甲基化。之所以最后講這個(gè)，是因?yàn)檫@個(gè)比較燒錢，而且后續(xù)的生物信息學(xué)分析比較復(fù)雜。WGBS & RRBS對(duì)于二代測(cè)序的方法，WGBS（Whole-Genome Bisulfite Sequencing）是目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”。WGBS 想必大家都已經(jīng)很熟悉了，但是考慮到 WGBS 成本較高，因此還有一種跟 WGBS 十分相似，但是只測(cè)基因組中的一部分的方法，即 RRBS（Reduced representation bisulfite sequencing）。
圖 21. WGBS & RRBS 的比較[10]兩者的差別在于，WGBS 通常使用超聲打斷整個(gè)基因組，并對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行重亞硫酸鹽處理和測(cè)序；但是 RRBS 使用 MspI 限制性內(nèi)切酶。RRBS 可以檢測(cè)到人類基因組中 85% 的 CpG 島。RRBS 大約需要 100ng-1ug 的 DNA，而對(duì)于 WGBS 而言，需要 50-100ng DNA。盡管 WGBS 被譽(yù)為檢測(cè) DNA 甲基化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是依然存在很多的不足。首先，重亞硫酸鹽必須轉(zhuǎn)化未甲基化的 DNA，否則會(huì)造成假陽性，不過目前我們可以通過加入 spike-in 作為對(duì)照來克服這個(gè)問題；還有，目前測(cè)到的 DNA 甲基化是多個(gè)細(xì)胞的平均甲基化狀態(tài)，單細(xì)胞的 DNA 甲基化檢測(cè)可能克服這個(gè)問題；其次，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，會(huì)降低基因組的復(fù)雜度，造成后續(xù)的 mapping 率不高；重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化還可能造成 DNA 斷裂，這使得擴(kuò)增長(zhǎng)片段比較困難。另外，WGBS 的成本還是非常高的。
