這篇文章于2023年8月發(fā)表于Cell Chemical Biology（IF=8.6，Small molecule targeting of transcription-replication conflict for selective chemotherapy），是最近網(wǎng)上熱議的特異性抗腫瘤“神藥”原文（by希望之城貝克曼研究所）。文章對小分子化合物的藥代動力學(xué)評估以及一些DNA損傷的檢測方法值得借鑒學(xué)習(xí)。至于該藥是否真的可以特異性殺傷腫瘤細(xì)胞并治療癌癥，大家見仁見智。

研究意義：DNA復(fù)制壓力（DNA replication stress）指DNA復(fù)制的延緩、抑制或者異常終止，會引起DNA損傷和基因組不穩(wěn)定。癌細(xì)胞因缺乏保護(hù)/修復(fù)復(fù)制叉的蛋白，以及持續(xù)激活的增殖信號通路，表現(xiàn)出明顯的DNA復(fù)制壓力【1】。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是重要的腫瘤進(jìn)展標(biāo)志物，對DNA復(fù)制和修復(fù)非常重要（圖0）。三個PCNA分子形成環(huán)繞DNA分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，為DNA聚合酶等DNA結(jié)合蛋白提供結(jié)合DNA分子的平臺。作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)ca-PCNA，隨后設(shè)計了靶向該異構(gòu)體的小分子化合物AOH1160【2,3】。AOH1160能顯著抑制腫瘤生長，但由于代謝等參數(shù)不佳無法進(jìn)入臨床試驗，于是作者設(shè)計了新的靶向ca-PCNA的化合物AOH1996。本文便是對AOH1996的藥代動力學(xué)、毒副作用和治療腫瘤效果的評估，以及對其作用機(jī)制的探索。

圖0

研究策略：?本文主要是根據(jù)前期發(fā)現(xiàn)的腫瘤較特異的標(biāo)志物ca-PCNA和設(shè)計的化合物AOH1160為背景，進(jìn)一步對該化合物進(jìn)行優(yōu)化，以找到代謝穩(wěn)定穩(wěn)定，適合臨床使用的化合物。這里作者找到AOH1996之后，在體內(nèi)和體外對其藥代動力學(xué)和腫瘤抑制效果進(jìn)行了評估，然后對其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

研究方法：

1.?Superior therapeutic properties of AOH1996

作者檢測了AOH1996對作用的特異性。AOH1996顯著抑制70多種癌細(xì)胞的生長，但對正常細(xì)胞影響較小（圖1A-C，人外周血單核細(xì)胞PBMCs、氣道上皮細(xì)胞hSEAC和神經(jīng)嵴干細(xì)胞7SM0032）。對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探究發(fā)現(xiàn)，AOH1996是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷抑制腫瘤生長（圖1D）。此外，AOH1996特異性將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M和S期、促進(jìn)其凋亡并增強(qiáng)順鉑和拓?fù)涮婵档瓤拱┧幬锏囊种菩Ч珜φ＜?xì)胞無顯著影響（圖1E-H）。

圖1

接著，作者對AOH1996的藥代動力學(xué)進(jìn)行檢測。小鼠體內(nèi)結(jié)果顯示，AOH1996半衰期、最高血藥濃度以及AUC（評價藥物吸收入血情況）相較于AOH1160顯著增加（圖2A）。實(shí)驗犬的結(jié)果與小鼠結(jié)果相似（圖2B）。所以，AOH1996具有口服活性，可作為臨床試驗備選藥。接下來作者評估了AOH1996治療腫瘤的潛力。每日給予小鼠AOH1996能顯著抑制腫瘤進(jìn)展，且對小鼠體重?zé)o顯著影響（圖2C-F）。此外，作者也以美國FDA標(biāo)準(zhǔn)檢測了AOH1996的藥物毒性作用，結(jié)果顯示無明顯毒副作用，且安全劑量能提高至6倍于有效劑量水平。對DNA損傷進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，只有AOH1996處理小鼠的腫瘤組織有γH2A.X和磷酸化ChK1表達(dá)（DNA損傷標(biāo)志），且其周圍常見被破壞的細(xì)胞（圖2G）。因此，AOH1996在體內(nèi)水平引起了DNA損傷和細(xì)胞凋亡。接下來，作者探究了AOH1996對患腫瘤小鼠生存情況的影響?？诜?/b>AOH1996雖然一定程度上促進(jìn)小鼠存活，但無統(tǒng)計學(xué)差異。單用CTP11（拓?fù)涿?/b>I抑制劑，抗腫瘤藥）或?qū)?/b>CPT11與AOH1996聯(lián)合用藥，顯著提高小鼠生存率（圖2H）。因此，雖然AOH1996在體內(nèi)和體外水平能特異性作用于腫瘤細(xì)胞并抑制其生長，且具有較好的口服活性，但單獨(dú)使用對實(shí)驗動物的存活情況影響不大。

圖2

2.?Modulating PCNA’s interaction with the transcription machinery

作者進(jìn)一步探討了AOH1996的作用機(jī)制。免疫共沉淀和質(zhì)譜結(jié)果顯示，AOH1996顯著改變了結(jié)合染色質(zhì)PCNA與蛋白的互作，大部分發(fā)生改變的蛋白是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白（圖3A）。這些蛋白里，組成RNA聚合酶II的亞單位，RPB1和POL2B是唯二含有PCNA結(jié)合位點(diǎn)（APIM motif）的蛋白。AOH1996增強(qiáng)PCNA與RPB1的互作，同時降低RPB1蛋白水平。相反，用可以阻斷PCNA結(jié)合位點(diǎn)的多肽處理細(xì)胞可阻滯PCNA和RBP1的結(jié)合，并使RPB1蛋白水平升高（圖3B-C）。將RPB1的PCNA結(jié)合位點(diǎn)氨基酸突變，PCNA和RPB1互作顯著減少，?RPB1蛋白水平增加，進(jìn)一步研究表明，PCNA和RPB1相互作用促進(jìn)了RPB1的蛋白酶體降解（圖3D-E）。用CRISPR/Cas9構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)突變的RPB1細(xì)胞株并用AOH1996處理，突變腫瘤細(xì)胞對處理敏感性顯著下降，且質(zhì)譜GO結(jié)果顯示，AOH1996引起的多數(shù)改變在WT細(xì)胞里更為明顯（圖3F-G）。因此，AOH1996通過促進(jìn)PCNA和RPB1結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞功能。

圖3

3.?Transcription dependent dissociation of PCNA from chromatin

PCNA和DNA復(fù)制密切相關(guān)，于是作者探討了PCNA和RPB1結(jié)合對DNA復(fù)制的影響。AOH1996促使PCNA從常染色質(zhì)區(qū)的解離，但不影響異染色質(zhì)區(qū)的PCNA（圖4A）。因此，AOH1996特異性破壞轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的DNA復(fù)制。檢測AOH1996對DNA復(fù)制叉延伸速度的影響顯示，AOH1996顯著抑制其延伸（圖4B，紅色鏈的長度顯示其延伸情況）。DNA損傷檢測結(jié)果顯示，AOH1996會誘發(fā)RPB1突變細(xì)胞株發(fā)生更嚴(yán)重的DNA損傷，抑制轉(zhuǎn)錄可以緩解這種損傷（圖4C-D）。轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突（TRC）是引起DNA損傷和基因組不穩(wěn)定的重要原因，常見于腫瘤，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)【4】。AH1996處理增加了腫瘤細(xì)胞的R-loops（促進(jìn)DNA損傷和基因組不穩(wěn)定），過表達(dá)RNA酶H1則能降低R-loop和DNA損傷，表明AOH1996通過促進(jìn)R-loop形成引起DNA損傷，從而抑制腫瘤生長（圖4E-F）。

圖4

Take-home message：

這篇文章是作者繼前期發(fā)現(xiàn)ca-PCNA并設(shè)計相應(yīng)靶向小分子AOH1160后的又一篇延續(xù)性工作（課題的延續(xù)性和系統(tǒng)性還是比較值得學(xué)習(xí)的），主要是對AOH1160代謝不穩(wěn)定進(jìn)行優(yōu)化，找到了具有口服活性且毒性低的新藥物AOH1996。雖然AOH1996在細(xì)胞實(shí)驗表現(xiàn)出較好的腫瘤特異性，且能在體內(nèi)抑制腫瘤生長，但卻不影響腫瘤模型小鼠的生存率（圖2H），那么這個藥的主要優(yōu)勢就是其腫瘤靶向特異性，但僅僅是由此導(dǎo)致的對增殖不旺盛細(xì)胞毒副作用小，對患者生存可能沒有太大用處（如果能加入更加經(jīng)典的抗癌藥對比可能得出更加明確的結(jié)論）。此外，PCNA在增殖細(xì)胞里高表達(dá)，作者正常組織選用PBMCs（干細(xì)胞少，多是成熟的血細(xì)胞）和hSEAC這類分化成熟的體細(xì)胞作為對照的邏輯有待商榷，且作者的結(jié)果顯示，AOH1996并非完全對正常細(xì)胞沒有影響（圖1B-C）。

所以，你還認(rèn)為這款腫瘤“特效藥”有媒體報道的那么神奇嗎？歡迎大家留言討論。

【參考文獻(xiàn)】

1．Ubhi, T.?et al.?Exploiting DNA Replication Stress for Cancer Treatment.?Cancer Research?79, 1730, doi:10.1158/0008-5472.CAN-18-3631 %J Cancer Research (2019).

2．Gu, L.?et al.?The Anticancer Activity of a First-in-class Small-molecule Targeting PCNA.?Clinical Cancer Research?24, 6053, doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-0592 (2018).

3．Malkas, L. H.?et al.?A cancer-associated PCNA expressed in breast cancer has implications as a potential biomarker.?PNAS?103, 19472, doi:doi:10.1073/pnas.0604614103 (2006).

4．García-Muse, T.?et al.?Transcription–replication conflicts: how they occur and how they are resolved.?Nature Reviews Molecular Cell Biology?17, 553, doi:10.1038/nrm.2016.88 (2016).