Cell 丨 基因編輯藥物的體內遞送方法

原創(chuàng)?珍奇?圖靈基因?2022-07-12 17:16?發(fā)表于江蘇

收錄于合集#前沿分子生物學技術

撰文：珍奇

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本篇綜述總結了用于治療性體內基因編輯的三種基因編輯劑，并概述了體內高效遞送載體的基本特征，描述了目前正在進行的臨床試驗的病毒和非病毒遞送方法，最后討論了病毒樣顆粒（VLP）遞送系統(tǒng)。作者結合每種策略的優(yōu)點和缺點，強調了各個方法在未來發(fā)展的方向。

體內基因編輯療法為治療許多遺傳性疾病的根源提供了可能。但想要使治療性體內基因編輯成為現(xiàn)實，目前的關鍵在于如何能安全有效地將基因編輯劑輸送到體內的相關器官和組織。2022年7月6日，麻省理工學院與哈佛大學的三名研究人員共同在《Cell》雜志上發(fā)表了一篇名為“Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents”的綜述。在此，他們回顧了目前用于實現(xiàn)治療性體內基因編輯的遞送技術（包括病毒載體、脂質納米顆粒和病毒樣顆粒），比較了每種方法的優(yōu)點和缺點并強調了未來改進的機會。

治療性基因編輯策略

圖1對三種基因編輯劑進行了簡要概述：核酸酶會產生有針對性的雙鏈DNA斷裂（DSBs，double-strand DNA breaks），通常會不可控地產生基因插入和基因缺失的混合物。在某些類型的分裂細胞中，DSBs也可以在有DNA供體模板存在的情況下形成同源定向修復（HDR，homology-directed repair）的結果，從而支持基因校正，盡管HDR通常也會伴隨著副產物的生成。而堿基編輯器（base editor）可針對堿基對進行轉換，起始子編輯器（prime editor）也可實現(xiàn)單核苷酸轉換、插入、缺失和組合，這兩種方式的副產物相對較少。

圖1.?治療性基因編輯技術概述

體內高效輸送工具的基本特征

基因編輯劑可以作為DNA、mRNA，甚至直接作為蛋白質或核糖核酸蛋白（RNPs）被送入細胞。具體來說，有效的體內遞送載體必須（1）在進入細胞前包裝并保護其貨物不被封存或破壞，（2）與所需的細胞結合，（3）穿越目標細胞膜進入細胞內部，以及（4）將其攜帶物質釋放到適當?shù)募毎麅雀糸g。

大多數(shù)強大的體內遞送工具將其載體封裝在蛋白質或脂質外殼中，以保護它們在進入細胞之前不被封存或降解。這種保護使所攜帶物質在循環(huán)中或在給藥部位存活，直到載體遇到目標細胞類型。此外，運載工具必須避免被免疫系統(tǒng)識別，因為免疫激活會導致它們成為降解的目標。一些載體成分容易激活補體系統(tǒng)，這可能導致載體被吞噬性免疫細胞清除，而抗體介導的遞送載體識別也可能導致吞噬性清除。

在將其載體送入細胞之前，體內運送工具必須首先能夠與體內的這些細胞結合。這種進入目標細胞的能力在很大程度上取決于運載工具的給藥途徑。許多靜脈注射的載體可以有效地進入一些組織（如肝臟），但由于內在的生物屏障（如血腦屏障），不能有效地進入其他組織（如中樞神經系統(tǒng)）。將載體局部注射到中樞神經系統(tǒng)（如通過鞘內注射）或眼睛（如通過視網(wǎng)膜下注射）可以繞過生物屏障，使其能夠進入某些重要的細胞群。然而，物理接觸特定細胞類型的能力并不能保證對該細胞類型的有效傳遞。遞送載體必須能夠針對所需的細胞，并且通常使用其表面的部分或特定的靶向分子來吸引目標細胞表面的受體，并促進隨后的細胞進入。在成功接觸目標細胞后，運載工具必須通過穿越細胞膜進入這些細胞。

在許多情況下，運載工具與細胞表面識別器的結合促進了這些運載工具的內吞作用。留在內體中的載體和貨物最終會被降解。因此，成功的運載工具必須逃出內體，在內體外釋放其載物，進入細胞膜。許多成功的運載工具利用內體的酸性環(huán)境，引發(fā)運載工具結構的變化，促進內體逃逸和貨物釋放。重要的是，高效的運載工具必須足夠穩(wěn)定，以便在細胞外保護其貨物，但必須能夠在進入細胞和逃離內體后分解和釋放其貨物。幾十年來，研究人員已經發(fā)現(xiàn)并發(fā)明了幾類能夠克服這些復雜分子障礙的細胞內遞送工具。目前最先進的遞送系統(tǒng)，包括病毒載體、LNPs和VLPs，可以滿足高效體內遞送載體的這些關鍵標準，因此很適合基因編輯劑的體內遞送。

圖2.?基因編輯劑高效體內輸送的要求

病毒遞送系統(tǒng)

病毒在進化過程中自然而然地克服了體內遞送的障礙，可以將核酸載體自然地遞送到許多細胞類型。由于這些有利的特性，病毒是傳遞基因編輯劑的重要載體。許多病毒載體已被開發(fā)用于體內基因治療應用，并在超過1000項臨床試驗中用于傳遞治療基因。大多數(shù)體內基因編輯應用都利用了腺相關病毒（AAVs），少數(shù)臨床前研究使用了慢病毒或腺病毒。值得注意的是，一項正在進行的臨床試驗使用AAVs將基因編輯劑送入眼睛，以治療一種遺傳性失明。圖3對病毒遞送系統(tǒng)進行了總結和對比。

圖3.?病毒傳遞方法的概述和比較

總的來說，病毒載體在許多臨床前研究和一項正在進行的臨床試驗中顯示了在體內傳遞基因編輯劑的巨大前景。迄今為止，病毒載體提供了一些在許多器官中觀察到的最高的基因編輯效率，因為它們具有在體內有效地轉導不同類型的細胞并傳遞其核酸載體的固有能力。未來對病毒載體的改進需要克服挑戰(zhàn)包括：載體的免疫原性、基因編輯劑的長期表達、非目標基因編輯、基因組整合的潛力、制造成本和劑量限制的毒性（圖3）。提高效力和組織特異性的載體工程方法可以減少所需劑量并降低病毒傳遞平臺的制造成本。在靶向編輯后持久沉默貨物表達的方法也將大大改善病毒傳遞的安全性。正如文中所討論的，混合病毒和非病毒策略可以通過結合病毒遞送的強大效率和非病毒遞送方法的瞬時性，提供兩個最佳方案。

脂質納米粒子(LNP)遞送系統(tǒng)

脂質納米顆粒（LNPs）作為在體內傳遞基因編輯劑的非病毒載體已經越來越受歡迎。幾十年來，脂質納米粒子一直被用來傳遞核酸載體，包括siRNA和治療性mRNA。為了將其封裝的攜帶物送入目標細胞，它們首先通過內吞作用進入細胞，在內體酸化后通過破壞內體膜逃離內體，隨后進入目標細胞的細胞膜。LNPs是完全合成的，通常由四種成分組成：一種陽離子或可電離的脂質、一種輔助脂質、一種聚乙二醇（PEG）脂質和膽固醇，圖4展示了LNP遞送系統(tǒng)的結構。LNPs由四個關鍵成分組成，可以有效地封裝各種RNA。封裝的?mRNA?通常通過在體外轉錄過程中加入替代核苷酸進行修飾，例如?N1-甲基假尿苷，以增加遞送后的細胞穩(wěn)定性。包封的向導?RNA?在多個位置進行了化學修飾，包括?2'-O-甲基化和硫代磷酸酯鍵，從而提高了向導?RNA?的穩(wěn)定性。

改變這些成分的特性可以產生針對不同的藥代動力學特征和不同類型細胞，具有不同特性的LNPs。經過廣泛的開發(fā)和優(yōu)化，LNPs已被美國FDA批準用于人體，包括通過靜脈注射給肝細胞提供治療性siRNA和通過肌肉注射給mRNA疫苗。如本文所述LNPs已經被用于臨床試驗，將Cas9核酸酶mRNA輸送到肝臟，并有望成為許多臨床體內基因編輯應用的首選輸送工具。

圖4.?脂質納米粒子（LNP）遞送系統(tǒng)

病毒樣顆粒(VLP)遞送系統(tǒng)

病毒樣顆粒（VLPs）已經成為傳遞基因編輯劑的潛在工具。VLPs是病毒蛋白的非傳染性集合體，它除了包裝所需遞送的mRNAs、蛋白質或RNPs外，還可以代替病毒基因材料。由于VLPs來自于現(xiàn)有的病毒支架，它們利用了病毒的自然特性，從而實現(xiàn)了高效的細胞內遞送，包括它們封裝貨物的能力，逃避內體的能力，以及重新編程以針對不同類型的細胞。然而，與病毒載體不同，VLPs以mRNA或蛋白質而不是DNA的形式瞬時傳遞基因編輯劑，這大大降低了脫靶基因編輯和病毒基因組整合的風險。由于這些原因，VLPs是傳遞基因編輯劑的有吸引力的載體，因為它們可以提供病毒和非病毒傳遞的關鍵優(yōu)勢。

圖5.?病毒樣顆粒（VLP）遞送系統(tǒng)

幾乎所有報道的用于傳遞mRNA或蛋白質載體的VLP架構都是基于逆轉錄病毒，因為逆轉錄病毒具有幾個非常適合VLPs的特性。未成熟的逆轉錄病毒顆粒是球形的，通常缺乏嚴格的結構對稱性，與大多數(shù)非二十面體病毒相比，這使得封裝所需載體的靈活性增加。此外，逆轉錄病毒的大顆粒直徑（100-200納米）為封裝大型載體（如Cas9）提供了更多的物理空間。最后，逆轉錄病毒在細胞定位和貨物包裝方面具有內在的模塊化；細胞類型的特異性由包膜糖蛋白決定，而攜帶物的包裝則由包膜蛋白控制。這種模塊化表明，能夠有效包裝所需貨物的VLP包膜結構可以很容易地與現(xiàn)有的各種包膜糖蛋白相結合，這些包膜糖蛋白目前被用于調節(jié)逆轉錄病毒的趨向性。雖然逆轉錄病毒VLPs作為mRNAs和蛋白質的運載工具已經被探索了幾十年，但最近的努力首次實現(xiàn)了VLPs在體內有效運載基因編輯劑的潛力。

教授介紹：

劉如謙?(David R. Liu)，美國華人化學家和生物學家，理查德-梅金教授和梅金醫(yī)療轉型技術研究所所長，麻省理工學院和哈佛大學布羅德研究所的副主席，哈佛大學自然科學的托馬斯-達德利-卡伯特教授，以及霍華德-休斯醫(yī)學研究所（HHMI）的研究員。他的研究將化學和進化結合起來，以闡明生物學和實現(xiàn)下一代治療方法。他的主要研究興趣包括基因組編輯蛋白（如堿基編輯）的工程、進化和體內輸送，以研究和治療遺傳疾病；利用噬菌體輔助連續(xù)進化（PACE）進化具有新型治療潛力的蛋白質；利用DNA誘導的有機合成和DNA編碼庫發(fā)現(xiàn)生物活性合成小分子和合成聚合物。他的實驗室開創(chuàng)了堿基編輯、質粒編輯、PACE和DNA模板合成四個技術，這些技術被世界各地成千上萬的實驗室所使用，并使許多遺傳疾病的研究和潛在治療成為可能。

參考文獻：

Raguram A, Banskota S, Liu DR. Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents [published online ahead of print, 2022 Jun 28]. Cell. 2022;S0092-8674(22)00395-6. doi:10.1016/j.cell.2022.03.045