胞外囊泡
胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）如外泌體，是一類直徑在30-200nm之間，具有磷脂雙分子層的細(xì)胞分泌小泡。大多數(shù)細(xì)胞都可分泌EV。由于攜帶遺傳物質(zhì)（如microRNA）和種類豐富的酶，EV通?？蓞⑴c細(xì)胞通信中免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)生物體的細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。因其自身屬性，包括：①參與細(xì)胞間通訊途徑，②無細(xì)胞毒性，③可控免疫原性，④組成性分泌，⑤額外生物功能分子的包囊，⑥功能蛋白在膜中的表達(dá)等，EV還具有細(xì)胞內(nèi)給藥優(yōu)勢(shì)而備受期待，有望成為下一代細(xì)胞治療的生物載體。
當(dāng)大量的EV被分泌到體液中時(shí)（血液中外泌體的含量約為3×10^6個(gè)/μL），這常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)EV的攝取競(jìng)爭(zhēng)，除此之外，EV膜的負(fù)電荷也會(huì)拮抗它們?cè)趲ж?fù)電的細(xì)胞膜上積聚。因此，為了實(shí)現(xiàn)有效的EV內(nèi)容物的細(xì)胞內(nèi)遞送，特別是在胞質(zhì)溶膠中，還需要一種完善的方法來提高EV的細(xì)胞攝取效率。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，癌癥相關(guān)受體（如表皮生長(zhǎng)因子受體）的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞的巨胞飲作用（伴有肌動(dòng)蛋白重組、質(zhì)膜皺折和大量細(xì)胞外液吞噬）并顯著提高EV的細(xì)胞攝取效率。功能性活化修飾的EV本身誘導(dǎo)的巨胞飲作用對(duì)于基于EV的治療分子的細(xì)胞內(nèi)傳遞，已被強(qiáng)有力地證明是行之有效的。
近期，日本學(xué)者Ikuhiko Nakase及其研究團(tuán)隊(duì)利用八聚精氨酸肽修飾EV，卓有成效地誘導(dǎo)了細(xì)胞巨胞飲作用和其對(duì)EV的攝取作用。他們證實(shí)，這是一種具有代表性的富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽（CPP），可被細(xì)胞有效內(nèi)化。
然而，寡精氨酸肽序列中精氨酸殘基的數(shù)量會(huì)影響其細(xì)胞攝取和細(xì)胞溶質(zhì)的釋放效率。在該研究中，該團(tuán)隊(duì)使用具有不同數(shù)量精氨酸殘基的寡精氨酸肽序列修飾EV膜，并探究了其如何影響巨胞飲作用的誘導(dǎo)、細(xì)胞EV攝取和EV內(nèi)容物的胞漿釋放。
每個(gè)寡精氨酸肽具有不同數(shù)量的精氨酸殘基（Rn:n=4,8,12,16），Rn-EMC（n-ε-馬來酰氨基丙氧基丁二酰亞胺酯）是一種胺-巰基交聯(lián)劑，寡精氨酸肽通過與Rn-EMC混合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)EV膜的修飾。
如圖1所示（略）
這是寡精氨酸肽修飾EV的細(xì)胞攝取示意圖。通過磺基EMCS連接物，EV可與寡精氨酸肽偶聯(lián)。
如圖2所示（略）
這是在37°C下，在10%含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，Rn-EMCS修飾的CD63 GFP EV（20μg/mL）在CHO-K1細(xì)胞中的相對(duì)細(xì)胞攝取效率的流式細(xì)胞術(shù)分析圖，該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)。寡精氨酸肽在EV膜上的結(jié)合顯著增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)EV的攝取。而共軛寡精氨酸肽中的精氨酸儲(chǔ)備數(shù)量更是直接影響細(xì)胞攝取效率。R8-EMCS或R12-EMCS的結(jié)合是所有寡精氨酸肽結(jié)合物中EV細(xì)胞攝取效率最高的。由于R8-或R12-EMCS的修飾，細(xì)胞EV攝取量高出29倍。
如圖3所示
這是在相同實(shí)驗(yàn)條件下，用Rn-EMC（n=8:20μM，n=16:10μM）修飾的FITC葡聚糖膠囊EVs（20μg/mL）處理CHO-K1細(xì)胞的共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，木糖基轉(zhuǎn)移酶是啟動(dòng)糖胺聚糖（GAG）合成所必需的酶，并且不產(chǎn)生可檢測(cè)水平的蛋白多糖，在質(zhì)膜上表達(dá)的蛋白多糖對(duì)細(xì)胞有效攝取寡精氨酸肽起著關(guān)鍵作用。
為了研究基于EV和細(xì)胞溶質(zhì)釋放的生物活性蛋白的遞送，該研究團(tuán)隊(duì)通過電轉(zhuǎn)染技術(shù)將核糖體失活蛋白saporin包囊在EV中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)最初封裝在EV中的saporin的細(xì)胞攝取和胞漿釋放增強(qiáng)是通過用R16-EMCS修飾EV膜實(shí)現(xiàn)的。并且每個(gè)寡精氨酸肽在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)不同的胞漿釋放效率，可能是由于R16的內(nèi)質(zhì)體膜擾動(dòng)能力高于短寡精氨酸。
概而論之，該研究發(fā)現(xiàn)通過修飾EV膜上的寡精氨酸肽可有效誘導(dǎo)巨胞飲作用和細(xì)胞EV攝取。而使用帶有EMCS連接物的寡精氨酸肽修飾EV膜，是一種無細(xì)胞毒性和簡(jiǎn)單可行有效方法，可為基于EV載體的細(xì)胞內(nèi)給藥系統(tǒng)提供新的研究思路。
我們發(fā)現(xiàn)，該研究團(tuán)隊(duì)在對(duì)EV進(jìn)行藥物加載的過程中，是通過電轉(zhuǎn)染的方法來完成的。而轉(zhuǎn)運(yùn)加載的效率對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的影響也至關(guān)重要。為了實(shí)現(xiàn)有效的EV包囊封裝，研究者們選擇NEPA GENE NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，并最終獲得了成功理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
NEPA21 采用獨(dú)特設(shè)計(jì)的電轉(zhuǎn)程序；電壓衰減（Voltage Decay）模式；基因?qū)?反向?qū)肽Ｊ?。不需特殊轉(zhuǎn)染試劑輔助，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本?？蓱?yīng)用于對(duì)細(xì)胞、組織和動(dòng)物活體的轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)參數(shù)實(shí)時(shí)可見、可調(diào)，適合對(duì)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件優(yōu)化。
參考資料：
1.Nakase, I., Noguchi, K., Fujii, I. & Futaki, S. Vectorization of biomacromolecules into cells using extracellular vesicles with enhanced internalization induced by macropinocytosis. Sci. Rep 6, 34937, doi:10.1038/srep34937 (2016).
2.Nakase, I. & Futaki, S. Combined treatment with a pH-sensitive fusogenic peptide and cationic lipids achieves enhanced cytosolic delivery of exosomes. Sci. Rep 5, 10112, doi:10.1038/srep10112 (2015).
3.Nakase, I., Kobayashi, N. B., Takatani-Nakase, T. & Yoshida, T. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Sci. Rep 5, 10300, doi:10.1038/ srep10300 (2015).?
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