2019-01-07 星期一 晴
1、周末答應(yīng)了三個(gè)病人導(dǎo)診。結(jié)果只來(lái)一個(gè)病人，給他安排了住院。其中一個(gè)病人直接爽約，另外一個(gè)病人臨了給我打電話(huà)說(shuō)沒(méi)來(lái)了，我猜可可能是去了別的醫(yī)院。
2、接著去細(xì)胞房關(guān)心細(xì)胞大哥。140細(xì)胞依舊不堪入目，黑色的點(diǎn)點(diǎn)逐日增加，嚴(yán)重影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)。將其拍攝下來(lái)，與同門(mén)商討策略，據(jù)悉，給我細(xì)胞的師弟，他后來(lái)的細(xì)胞也污染得一塌糊涂。所以，我準(zhǔn)備讓師弟再郵寄細(xì)胞給我，重新來(lái)過(guò)。另外，510細(xì)胞今日也出現(xiàn)少許黑色的點(diǎn)點(diǎn)，希望不要在增加了。（上天保佑）
3、與YB公司電話(huà)聯(lián)系，確認(rèn)het-1a細(xì)胞成功下單，希望這周細(xì)胞就能夠順利抵達(dá)。
4、ZB兄弟告訴我，他昨天使用研缽地提取了組織RNA，而且濃度和純度都達(dá)標(biāo)了，真是可喜可賀啊，我虛心地向他求教了個(gè)中的經(jīng)驗(yàn)。說(shuō)實(shí)話(huà)，這位小兄弟挺厲害的，他不僅動(dòng)手能力強(qiáng)，而且善于思考，將來(lái)一定大有前途！
5、中午吃飯的時(shí)候，和病理科的醫(yī)生探討了病理切片的事宜，隨后決定先切50片的標(biāo)本先行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索抗體濃度、操作流程等。更欣慰的是，訂購(gòu)的50片的載玻片和目標(biāo)抗體也相繼送達(dá)了。
6、午飯過(guò)后，我開(kāi)始細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，把僅存的140細(xì)胞也復(fù)蘇了。這次更換了新的1640、FBS、PBS、胰酶，這次如果在出現(xiàn)黑點(diǎn)點(diǎn)，只能說(shuō)明細(xì)胞從頭就污染了。細(xì)胞傳代時(shí)的胰酶消化時(shí)間，以及傳代比例還有待進(jìn)一步摸索、改進(jìn)。
7、按照既定的westernblot學(xué)習(xí)計(jì)劃，準(zhǔn)備開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。我把污染相對(duì)較輕的140細(xì)胞消化下來(lái)，用以提取總蛋白。同樣510細(xì)胞也留取了2管用以提蛋白。

細(xì)胞總蛋白的提取:
1.倒掉培養(yǎng)液，PBS洗兩遍。
2.每瓶細(xì)胞加1ml 胰酶消化細(xì)胞，2-3分鐘，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙變大，震蕩細(xì)胞可漂浮，加入2ml培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清。加入1mlPBS洗滌細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至EP管，離心，棄上清。
3、配置RIPA裂解液：按1ml裂解液加10μl 的PMSF（100mM），離心、搖勻置于冰上。
4.每個(gè)EP管加150μl含PMSF的裂解液，冰上裂解15min，為使細(xì)胞充分裂解。
5.于4℃下12000rpm離心15min。(提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷)
6.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中放于-20℃保存。

8、隨后開(kāi)始BCA蛋白濃度測(cè)定。

BCA蛋白濃度測(cè)定：
1、稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：取8支EP管，每管加30ulPBS，第一管加30ulBSA，混勻后再取30ul至第二管，依次倍比稀釋?zhuān)詈笠还懿患訛榭瞻祝幢镜字担?。則8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。
2、【忘記稀釋了】5倍稀釋樣品蛋白：取3支EP管（3個(gè)樣品），各管加40ul RIPA，再分別取10ul樣品在各管中稀釋
3、將8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋待測(cè)樣品各加25ul于96孔板中。
4、配制BCA工作液：每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)（第一次做，未做2個(gè)重復(fù)），再加上8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，一共14個(gè)孔，按16個(gè)孔算，以防加樣損失。則需A液：200ul×16=3200ul，B液：4400ul/50=88ul，計(jì)算好所需體積后在一干凈試管中將A、B工作液混勻。
5、混勻后立即向各孔中加入200ul配制的BCA工作液，振蕩30min，37℃孵育30min。
6、酶標(biāo)儀562nm下測(cè)定各樣品和BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度?！居捎谖聪♂?zhuān)Y(jié)果濃度太高遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍，機(jī)器未能給出讀數(shù)】
7、根據(jù)各樣品濃度計(jì)算1×loading buffer體積，將各樣品濃度調(diào)為一致；并計(jì)算5×loading buffer的體積，加入各管中?；靹蚝蠓兴?5min，冰上分裝，存于-20℃。

8、已經(jīng)預(yù)約了明天的WB，希望順利。