生信小課堂

本文的思路是通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析識(shí)別了某種免疫細(xì)胞特有的marker基因，然后利用這些基因進(jìn)行預(yù)后模型的構(gòu)建。事實(shí)上，預(yù)后模型的文章已經(jīng)不好發(fā)了，甚至有的審稿人看到預(yù)后模型就反感，因?yàn)閷?shí)在是太多了，而且預(yù)測(cè)效能普遍不行。那么如何做的比這篇文章還要好呢？鑒于最近泛癌分析以及腫瘤分型分析比較好發(fā)，小編做的免疫細(xì)胞marker的泛癌分析以及腫瘤分型，內(nèi)容是這些文章的2倍以上，均發(fā)表到8+雜志。所以我們?cè)诤Y選到某種免疫細(xì)胞特有的marker基因后，可以對(duì)這些基因進(jìn)行泛癌分析或者腫瘤分型分析。在分型分析中再附上簡(jiǎn)單的預(yù)后模型，但不以其為重點(diǎn)。這樣的思路肯定是比本篇文章內(nèi)容更多，更新穎。如果想做類似分析，歡迎交流。
研究概述：

中性粒細(xì)胞是腫瘤中最豐富的免疫細(xì)胞群之一。本研究旨在研究非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）腫瘤免疫微環(huán)境(Time)中復(fù)雜的通訊網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)分析中性粒細(xì)胞分化的特點(diǎn)，闡明免疫細(xì)胞與腫瘤之間的相互作用，建立預(yù)測(cè)患者免疫應(yīng)答和預(yù)后的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。在研究中，整合單細(xì)胞RNA采用NSCLC標(biāo)本和大體積RNA-seq的序列分析(scRNA-seq)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。作者鑒定了28個(gè)主要的細(xì)胞簇，并闡明了它們之間的相互作用。其次，作者發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同階段的中性粒細(xì)胞亞群，與免疫調(diào)節(jié)和代謝途徑密切相關(guān)。根據(jù)4個(gè)管家基因(ACTB、GAPDH、TFRC、TURB)的比值，作者建立了MS4A7、CXCR 2、CSRNP 1、RETN、CD 177和LUCAT 1等6個(gè)中性粒細(xì)胞分化相關(guān)基因(NDRGS)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，并對(duì)患者的總生存期和免疫治療反應(yīng)進(jìn)行了成功預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。最后，本研究探討了6個(gè)預(yù)后基因?qū)е翹SCLC預(yù)后不良的原因，篩選了針對(duì)預(yù)后基因抗腫瘤效應(yīng)的小分子化合物。

研究結(jié)果：

一、細(xì)胞類型的鑒定

1.所有細(xì)胞通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序被聚類為28個(gè)簇，并被進(jìn)一步標(biāo)注為10種細(xì)胞類型（圖1A和B）。分別對(duì)淋巴免疫細(xì)胞群（T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞）、髓免疫細(xì)胞群（單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞）和上皮細(xì)胞/癌細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的亞群聚類。T淋巴樣免疫細(xì)胞簇進(jìn)一步分為14個(gè)簇，通過(guò)注釋確定了七個(gè)主要子組。（圖1D和E）髓系免疫細(xì)胞被分為15個(gè)細(xì)胞簇，確定了7個(gè)主要亞群（圖1F和G）。

2.分析正常上皮細(xì)胞，獲得18個(gè)細(xì)胞簇，確定了九個(gè)主要的亞組（圖1H和I）。28種細(xì)胞類型的標(biāo)記基因表達(dá)水平如圖所示。

二、TIME中的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)研究

1.作者在TCGA隊(duì)列中注釋了上述28個(gè)細(xì)胞，顯示了細(xì)胞豐度的比例（圖2A）?；颊哂绕涫悄[瘤患者的中性粒細(xì)胞含量明顯高于正常人，可能與腫瘤中中性粒細(xì)胞的促瘤和抑瘤特性有關(guān)。

2.隨后，基于28個(gè)細(xì)胞簇對(duì)微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析（圖2B）。

三、中性粒細(xì)胞的不同分化特點(diǎn)

1.使用Monocle進(jìn)行偽時(shí)間軌跡中性粒細(xì)胞亞群分析。中性粒細(xì)胞被分為四種不同的分化階段（圖3A和B），NDRGs具有高度的突變性和異質(zhì)性，提示NDRGs在中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。（圖3I和H）

2.隨后，進(jìn)行GSEA（圖3C-F）。作者發(fā)現(xiàn)了四種不同的中性粒細(xì)胞分化階段及其NDRGs的高致突變性和異質(zhì)性。

四、建立穩(wěn)定有效的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型

1.為了構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，作者將TCGA隊(duì)列分為訓(xùn)練集（n=731）和內(nèi)部驗(yàn)證集（n=283），并將GEO隊(duì)列（n=80）分為外部驗(yàn)證集。此外，NDRGs和DEGs（圖4A）被交叉（圖4B），交叉的基因被用來(lái)建立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。8個(gè)與預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因被識(shí)別（圖4C和D），通過(guò)多變量Cox回歸分析確定了6個(gè)穩(wěn)定的重要預(yù)后基因（圖4E）及其回歸系數(shù)并驗(yàn)證。按風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分組的三個(gè)隊(duì)列的生存率差異顯著，表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可作為患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。（圖4F-H）

2.使用預(yù)后特征建立列線圖（圖4I）?？潭惹€1年、3年和5年生存率顯示實(shí)際生存率和列線圖預(yù)測(cè)的生存率之間重疊度高（圖4J）。

五、預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的免疫預(yù)測(cè)及臨床應(yīng)用

1.ssGSEA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高危組大部分免疫細(xì)胞的含量明顯低于低危組，高危組免疫預(yù)后較差。（圖5A）

在比較了6個(gè)預(yù)后基因在預(yù)測(cè)NSCLC患者免疫應(yīng)答中的表現(xiàn)后，作者研究了臨床特征與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的關(guān)系。年齡和分期顯著相關(guān)（圖5C-H）。單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與預(yù)后顯著相關(guān)。（圖5I），多變量Cox結(jié)果也證明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是非小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。（圖5J）

六、探索六個(gè)預(yù)后基因的功能

1.作者進(jìn)一步探討了六個(gè)預(yù)后基因的表達(dá)、生存和途徑改變。首先，對(duì)于MS4A7，它在腫瘤中被下調(diào)，而MS4A7的低預(yù)后預(yù)測(cè)更差（圖6B）。GSVA低表達(dá)后的結(jié)果表明MS4A7參與各種免疫和抗炎反應(yīng)（圖6H）。同樣，CXCR2在腫瘤組織中以低水平表達(dá)（圖6A），低表達(dá)的CXCR2的預(yù)后更差（圖6D）。

2.在CXCR2低表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子和細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)等免疫活動(dòng)相關(guān)途徑也表現(xiàn)出下調(diào)狀態(tài)（圖6I），LUCAT1參與了促進(jìn)NSCLC發(fā)生和發(fā)展的各種過(guò)程（圖6A和C）。在LUCAT1過(guò)度表達(dá)之后，大多數(shù)生物代謝途徑，包括與癌癥相關(guān)的途徑顯著增加（圖6J），相反，CD177基因在腫瘤組織中高度表達(dá)（圖6A）。在高表達(dá)后，預(yù)后相對(duì)更好（圖6G）。在過(guò)度表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)IL-17信令通路等信號(hào)通路的活性顯著上調(diào)（圖6K），CD177與大多數(shù)免疫細(xì)胞的豐度呈正相關(guān)。此外，腫瘤組織中的CSRNP1和RETN被下調(diào)（圖6A），但兩者的下調(diào)預(yù)測(cè)水平更好（圖6E和F），它們和大多數(shù)免疫細(xì)胞的豐度呈正相關(guān)。

3.在CSRNP1低表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄相關(guān)途徑的活性下降，包括剪接體snRNP assem-bly（圖6L）。RETN低表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Chemokine信號(hào)通路和Neutro-phil相關(guān)通路的動(dòng)動(dòng)關(guān)系明顯下調(diào)（圖6M）。

七、預(yù)后基因的小分子化合物對(duì)接

使用CTD數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，Autodock分子對(duì)接和藥物毒理學(xué)研究確定了5種靶向預(yù)后基因的藥物。雌二醇能夠與MS4A7緊密結(jié)合并上調(diào)MS4A7 mRNA表達(dá)，其分子對(duì)接的模擬結(jié)合能為-4.23（kcal/mol）。（圖7A）改善CXCR2mRNA表達(dá)增加的小分子化合物中，Abrine 的最佳對(duì)接結(jié)合能為? 4.58 （kcal/mol） （圖 7B）離奧霉素可以有效地結(jié)合RETN并增加其mRNA表達(dá)水平，高水平結(jié)合能為-7.91（kcal/mol）。（圖7C）倍氯米松在尋找增強(qiáng)CSRNP1表達(dá)的小分子化合物時(shí)表現(xiàn)出-10.97（kcal/mol）的高水平對(duì)接結(jié)合能（圖7D）。在篩選上調(diào)CD177 mRNA的小分子化合物時(shí)，XL147分子對(duì)接結(jié)合能最高，為?8.36（kcal/mol）（圖7E）。

研究總結(jié)：在這項(xiàng)研究中，作者結(jié)合了兩個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)明TIME中的復(fù)雜細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)，并表征了中性粒細(xì)胞的不同分化階段和NDRG。作者建立了一種預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，該模型可用于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后表現(xiàn)和免疫治療效果。最后，該研究討論了預(yù)后基因?qū)е骂A(yù)后不良的原因，并篩選藥物是否存在預(yù)后基因，從而為靶向治療提供了新的見解。