整合應激反應

1. Ischemia/Reperfusion Is Associated With Decreased Protein Synthesis

為了探究I/R下心肌的全局變化，作者使用H9C2體外構建了I/R模型，對蛋白質進行了質譜檢測(a)。富集結果顯示翻譯是最顯著的通路(b)。接著作者使用wb進行了驗證。在使用H9C2進行缺血處理4h，隨后灌注不同時間。在細胞收取15分鐘前，使用了puromycin處理，以在不影響細胞存活的情況下標記新合成的蛋白。對puro標記蛋白的WB結果驗證了I/R引起H9C2蛋白合成下降(c, d)。在小鼠胚胎成纖維細胞上也發(fā)現(xiàn)了類似的結果(e, f)。小鼠模型上也得到了一致的結果(g, h)。

2. PERK/eIF2α Signaling Is Activated by I/R

蛋白翻譯過程受到多個層面的調控。而翻譯起始時最重要的步驟。ISR在被多種刺激激活后，可以抑制翻譯起始從而重塑細胞穩(wěn)態(tài)。其中關鍵的調控樞紐是eIF2a，其在絲氨酸51位的磷酸化可以引起eIF2B的抑制，并抑制翻譯起始。
為了探究ISR是否參與I/R中的蛋白翻譯抑制，作者首先檢測了eIF2a的磷酸化。結果顯示eIF2a的磷酸化存在快速的顯著增加(a, b)。體內試驗也得到了一致的結果(c, d)。
由于eIF2a有四個上游激酶：HRI, PKR, PERK和GCN2，作者首先探究了是哪種激酶參與了eIF2a的磷酸化，發(fā)現(xiàn)I/R處理的H9C2種只有PERK顯著磷酸化(E)，動物樣本也得到同樣的結果(f)。對時間點的檢測發(fā)現(xiàn)p-PERK存在快速活化(g, h)。
Collectively, these data suggest that the PERK/eIF2α axis of the ISR is activated by I/R to inhibit protein translation.

3. PERK Protects the Heart From Reperfusion Injury In Vivo

接著作者構建了心肌特異性PERK敲除鼠，構建IR模型后發(fā)現(xiàn)敲除鼠心臟梗死面積增大，心功能惡化。而PERK敲入鼠則對IR起到保護作用。
These findings together suggest that PERK is necessary and sufficient to confer cardioprotection against reperfusion injury in vivo.

4. PERK/eIF2α Signaling Protects Cardiomyocytes From Reperfusion Injury In Vitro

為了探究PERK/eIF2α通路的作用是否是cardiomyocyte-autonomous，作者首先在體外沉默了PERK (a)，發(fā)現(xiàn)細胞存活下降，死亡增加(b)。使用PERK抑制劑抑制PERK磷酸化和eIF2a活化也引起了心肌活率下降(c, d)。在成纖維細胞中也存在類似的現(xiàn)象(e)。同樣的，PERK過表達引起了H9C2, 原代心肌和成纖維的死亡下降(f, g)。突變 eIF2a磷酸化位點絲氨酸51位可以阻斷PERK激活對細胞存活率的影響(h, i)。
Taken together, these data support that the PERK/eIF2α axis of the ISR protects cells from reperfusion injury in vitro.

5. Activation of PERK/eIF2α Signaling Suppresses Protein Synthesis

接著作者探究了抑制蛋白合成是否是PERK介導的心臟保護作用的潛在機制。因此作者在PERK double transgenic mice，使用了dimer去激活PERK和其下有靶點eIF2a，發(fā)現(xiàn)激活PERK可以引起體內蛋白合成的下降(a)。H9C2細胞中PERK的激活可以引起蛋白翻譯抑制(b)。在心臟過表達PERK進一步降低了IR小鼠心臟的蛋白合成，而PERK cKO阻斷了灌注引起的蛋白合成下降(c)。接著作者在H9C2中激活了PERK/eIF2a信號通路，并使用ISRIB抑制了eIF2a的磷酸化，發(fā)現(xiàn)ISRIB起到了保護作用(d, e)。

6. PERK Suppresses Protein Synthesis of Mitochondrial Complexes

由于ISR的激活對蛋白合成具有全局抑制作用，作者想要探究IR中心肌ISR的激活是否存在選擇性靶點。RNAseq結果顯示過表達PERK引起了線粒體通路的顯著富集，提示其可能參與線粒體蛋白的調控(a)。接著作者驗證了PERK對線粒體蛋白復合體表達的影響，發(fā)現(xiàn)敲低PERK促進了NDUFAF2的表達(b, c)，而過表達PERK后NDUFAF2的表達受到最顯著的抑制(d, e)。沉默PERK引起了ROS的增加(g, h)，而過表達PERK降低了ROS (i, j)。使用 Mito-TEMPO, a mitochondrial superoxide scavenger, 顯著減輕了PERK 沉默引起的細胞死亡(k)。In aggregate, these findings strongly suggest that the PERK/eIF2α axis of the ISR selectively targets mitochondrial complexes to decelerate electron transfer, reduce ROS production, and protect cardiomyocytes from reperfusion damage.

7. ISR Activation Protects the Heart From Reperfusion Injury In Vivo

最后作者探究了eIF2a抑制劑Salubrinal的治療效果，發(fā)現(xiàn)其可以改善I/R。