一、Native-PAGE原理
非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等變性劑的條件下， 對保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于同工酶的鑒定和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性，對于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進(jìn)行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對某個特定的生物大分子進(jìn)行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。
二、Native-PAGE實驗方法
非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性sds-page電泳在操作上基本上是相同的，只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等。一般蛋白進(jìn)行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時候，要利用低pH凝膠系統(tǒng)，分離酸性蛋白時候，要利用高pH凝膠系統(tǒng)。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會帶負(fù)電荷，蛋白會相陽極移動；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離酸性蛋白。
三、工作液配制
1.30%膠貯液(Acr:Bis=29：1）;
2.4×分離膠Buffer(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調(diào)pH 8.8，加水定容到100ml，4℃?貯存；
3.4×堆積膠Buffer(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調(diào)pH 6.8，加水定容到100ml，4℃?貯存；
4.10×電泳Bufferfer（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1L，4℃?貯存；
5.2×溴酚藍(lán)上樣Buffer:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚藍(lán)，5.5ml dH2O； -20℃貯存；
6.10％APS；?
7.0.25％考馬斯亮藍(lán)染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；
8.考馬斯亮藍(lán)脫色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O。
四、電泳膠的配制及電泳條件（上槽電極為負(fù)，下槽電極為正）
1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml)
2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml3. 4×分離膠Buffer(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml?4. 4×堆積膠Buffer(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10％APS ?35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×電泳Buffer（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀釋到1L
五、電泳條件
100V恒壓約20min，指示劑進(jìn)入濃縮膠；改換160V恒壓，當(dāng)指示劑移動到膠板底部時，停止電泳，整個過程約80min。????染色和脫色：取出膠板于0.25％考馬斯亮藍(lán)染色液中染色約30min，傾出染色液，加入考馬斯亮藍(lán)脫色液，緩慢搖動，注意更換脫色液，直至膠板干凈清晰背景。也可以用銀染或者活性染色。六、分離堿性蛋白 要用低pH凝膠系統(tǒng)，并使用以下緩沖液體系：????1. 分離膠：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；????2. 堆積膠：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；????3. 電泳緩沖液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5????將正負(fù)電極倒置，用甲基綠（0.002%）為示蹤劑，實驗操作同分離酸性蛋白。七、切膠回收（單條帶純化）????native-PAGE結(jié)束以后，可以將蛋白條帶進(jìn)行切膠回收的方法進(jìn)行純化，方法如下：先跑Native PAGE，然后用預(yù)冷的0.25M KCl染色（預(yù)先放在4度冰箱中），目的條帶會出現(xiàn)白色條帶，根據(jù)你已經(jīng)跑過的考馬斯亮藍(lán)染色的位置可以判斷哪條帶是你的目的條帶，如果蛋白濃度高的話，染1分鐘就可以看到目的條帶，蛋白濃度低的話，要染時間長一些，大概5-10分鐘，如果太低，估計是看不到目的條帶了。無法用此方法看到目的條帶。那用該方法就不行了。
注意：蛋白濃度底，目的條帶顏色很淺，要在背景深色的時候才能看到（可以放在透明的玻璃板上操作），因為這種染色方法靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色低很多。
當(dāng)看到目的條帶時，可用一干凈的刀片切下目的蛋白所在的凝膠條帶，將凝膠條放在蒸餾水里浸泡，直至無色透明，目的是使得KCl離開膠條（當(dāng)然目的蛋白會損失一些，但絕大多數(shù)還在膠里，因為這個自由擴(kuò)散的過程不會太久），一般也就是五到十分鐘就可以目測觀察到膠條變成無色透明狀。
將無色透明的膠條從蒸餾水中取出，裝入一準(zhǔn)備好的1.5ml離心管中，用鑷子夾碎（或在放入離心管之前用刀片切碎），我常用的是滅過菌的鑷子夾碎。然后再在管里加入你所需要溶解蛋白的溶液，比如蒸餾水（生理鹽水或PBS等）。將離心管放入4度冰箱過夜，第二天吸出管中的液體（吸之前震蕩一下），至少50%蛋白可以從凝膠中析出（這要看你的凝膠和水溶液的體積比）。再加入蒸餾水抽提兩次，就可以將膠條中絕大部分蛋白抽提出。
多次抽提的蛋白經(jīng)Brandford考馬斯亮藍(lán)染色法測蛋白濃度測定，證明濃度依次遞減，后一次的濃度均不超過上次的50%。對于后面抽提的濃度比較低的，可以進(jìn)行濃縮。
切膠回收得到的蛋白濃度可達(dá)到1mg/ml。經(jīng)電泳檢測，只有單一條帶。無任何雜帶。
也可用普通的水平電泳槽回收蛋白：將條帶裝到透析袋里(透析袋截流量最好不要大過分子量的1/3)，利用電泳將蛋白從凝膠里分離出來，一般80V 2h即可。
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